陳麗虹 舒 珊 陳麗紅 韋 曦
轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(trans-forming growth factor-β,TGF-β)為一種多肽類生長(zhǎng)因子,可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、黏附和遷移,刺激成纖維細(xì)胞分裂。Smad是TGF-β家族信號(hào)傳導(dǎo)的下游因子,介導(dǎo)TGF-β信號(hào)由胞質(zhì)傳入胞核。鋅指E盒結(jié)合同源框2(zinc-finger E-box binding homeobox 2,ZEB2)屬于ZEB家族,又稱Smad結(jié)合蛋白1(Smad-interacting protein1,SIPl),是一類核轉(zhuǎn)錄因子[1]。ZEB2可結(jié)合TGF-β信號(hào)通路中的R-Smad,在TGF-β信號(hào)刺激下,ZEB2與R-Smad-Smad4復(fù)合體直接結(jié)合,調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[2]。
在一定條件下,牙髓細(xì)胞可分化為成牙本質(zhì)樣細(xì)胞,形成修復(fù)性牙本質(zhì)以保護(hù)牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體。TGF-β1在牙髓細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞均可合成,牙髓受到刺激或損傷時(shí)分泌進(jìn)入牙髓組織的TGF-β1能夠促進(jìn)牙髓細(xì)胞增殖,分泌細(xì)胞外基質(zhì),誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化,并已證實(shí)hDPCs的分化可由TGF-β1/Smad信號(hào)通路介導(dǎo),但ZEB2在人牙髓組織和細(xì)胞中的表達(dá)以及與TGF-β1的作用關(guān)系尚不明確[3]。本實(shí)驗(yàn)采用FISH觀察ZEB2在牙髓組織的定位和表達(dá),RT-qPCR和FISH檢測(cè)ZEB2在正常和TGF-β1刺激hDPCs中的表達(dá),為進(jìn)一步探討ZEB2在hDPCs成牙本質(zhì)向分化中的作用提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
1.1 主要材料和設(shè)備 DMEM低糖培養(yǎng)基(Gibco,美國(guó));標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清FBS,I型膠原酶,0.25%胰蛋白酶,0.02%乙二胺四乙酸(Gibco,澳大利亞);青鏈霉素(Sigma,美國(guó));培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)孔板(Corning,美國(guó));TGF-β1(Peprotech,美國(guó));Trizol試劑(Invitrogen,美國(guó));反轉(zhuǎn)錄cDNA合成試劑盒,SYBR Green I Master,LightCycler480熒光定量PCR儀(Roche,瑞士);4%多聚甲醛(含0.1%DEPC水)、Triton X-100、甲酰胺、無(wú)水乙醇、0.1%DEPC水、探針雜交液、DAPI染色液、熒光原位雜交探針(柏信生物有限公司),抗熒光衰減封片劑,超微量高精度分光光度計(jì)Nanodrop ND-2000(Thermo,美國(guó)),Axio observer Z1熒光倒置顯微鏡(Zeiss,德國(guó)),LSM710激光掃描共聚焦顯微鏡(Zeiss,德國(guó))。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 人牙髓組織切片的制備 經(jīng)患者知情同意收集中山大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科就診患者中因阻生或正畸需要拔除的健康第三磨牙(患者年齡18-25歲,無(wú)系統(tǒng)性疾病,牙周狀況良好,近兩個(gè)月內(nèi)未服用免疫制劑和抗生素),將新鮮收集的第三磨牙劈開(kāi)后置入預(yù)冷的4%多聚甲醛溶液中,4℃固定3d,后置入10%EDTA脫鈣液3-4個(gè)月,選擇來(lái)源于不同患者的三個(gè)牙齒進(jìn)行梯度酒精脫水,石蠟包埋,制作4μm厚的石蠟切片。
1.2.2 熒光原位雜交技術(shù)(FISH)檢測(cè)ZEB2在正常牙髓組織的定位和表達(dá) ZEB2熒光探針按以下序列合成:5‘-TGGTGAAATGAGGGCTTGCGA-3’,3’末端標(biāo)記6-羧基熒光素(6-FAM)。牙髓組織石蠟切片脫蠟,梯度酒精復(fù)水,30%亞硫酸氫鈉液處理20min,25mg/ml蛋白酶K孵育40min,洗滌,梯度酒精脫水,風(fēng)干。探針變性,雜交緩沖液與探針混合后逐滴加入至組織切片。37℃雜交過(guò)夜。50%甲酰胺與2倍檸檬酸鈉緩沖液(2XSSC)洗滌,梯度酒精脫水。DAPI染色,生理鹽水洗滌,風(fēng)干。抗熒光衰減封片劑封片,激光共聚焦顯微鏡觀察。陰性對(duì)照組按以上條件處理但不加入探針。
1.2.3 人牙髓細(xì)胞的培養(yǎng) 收集中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科18-25歲因正畸或阻生需要拔除的健康恒牙(患者均知情同意),消毒后沿牙頸部劈開(kāi)取出牙髓,去除根尖1/3根髓后,剪成1*1mm2大小的組織塊,3.3mg/mlⅠ型膠原酶37℃消化15min后離心,將組織塊鋪于培養(yǎng)瓶底,加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,倒置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱6-8h,待組織塊貼壁后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶。倒置顯微鏡下觀察,待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%-80%匯合,0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化后按1:2比例傳代。傳代細(xì)胞置于37℃常規(guī)培養(yǎng)箱,2-3d換液。
1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 使用DMEM培養(yǎng)基配制含TGF-β1的細(xì)胞培養(yǎng)液,濃度設(shè)定為0、2.5、5、10、20ng/ml,取生長(zhǎng)良好的hDPCs接種至6孔板(每孔細(xì)胞數(shù)為2×105),每組三孔,在含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h后,加入含不同濃度TGF-β1的細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h后,細(xì)胞生長(zhǎng)約達(dá)到六孔板的70%-80%。RT-qPCR檢測(cè)ZEB2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量,確定最大效應(yīng)濃度。根據(jù)上一步確定TGF-β1的最大效應(yīng)濃度為5ng/ml,實(shí)驗(yàn)組以5ng/ml TGF-β1 刺激培養(yǎng) 0h、2h、6h、12h、24h、48h、72h,對(duì)照組不加入TGF-β1,檢測(cè)hDPCs中ZEB2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。Trizol試劑提取總RNA,超微量高精度分光光度計(jì)測(cè)量總RNA濃度。引物的設(shè)計(jì)及合成均由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司完成,引物序列見(jiàn)表1。使用1μg體系反轉(zhuǎn)錄總RNA成為cDNA,20μl體系進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增40個(gè)循環(huán),包括10min預(yù)變性,95℃變性,60℃退火,72℃延伸及10min的延伸。采用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
表1 本實(shí)驗(yàn)所用的R T-P C R引物序列
1.2.5 FISH技術(shù)檢測(cè)ZEB2在正常和TGF-β1刺激hDPCs的定位和表達(dá) 分別取正常和5ng/ml TGF-β1培養(yǎng)24h的細(xì)胞做爬片,4%多聚甲醛(含0.1%DEPC水)固定20min,蒸餾水洗,0.5%Triton X-100通透15min,PBS洗滌,酒精脫水。分別進(jìn)行探針變性,雜交緩沖液與探針混合后逐滴加入至細(xì)胞爬片,37℃雜交過(guò)夜。50%甲酰胺與2倍檸檬酸鈉緩沖液(2XSSC)洗滌,酒精脫水。DAPI染色,生理鹽水洗滌,風(fēng)干。抗熒光衰減封片劑封片,激光共聚焦顯微鏡觀察。陰性對(duì)照組按以上條件處理但不加入探針。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。先檢驗(yàn)各樣本方差齊性,若符合方差分析條件,兩組間比較采用t-test,若不符合方差分析條件則使用秩和檢驗(yàn)。使用LSD和Dunnett檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05,p值小于0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 ZEB2在牙髓組織中ZEB2的定位和表達(dá) 如圖1所示,實(shí)驗(yàn)組中ZEB2陽(yáng)性表達(dá)主要集中于成牙本質(zhì)細(xì)胞層,呈綠色熒光,牙髓細(xì)胞中表達(dá)較弱;陰性對(duì)照組未見(jiàn)ZEB2陽(yáng)性染色細(xì)胞。
圖1 ZEB2在正常人牙髓組織的FISH檢測(cè)(激光共聚焦顯微鏡,×200)
2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)ZEB2在不同濃度TGF-β1作用下的表達(dá):隨TGF-β1劑量增加,hDPCs中ZEB2 mRNA的表達(dá)逐漸上調(diào),5ng/ml達(dá)最大(P< 0.05),10-20ng/ml有下降趨勢(shì),見(jiàn)表2。
表2 不同濃度TGF-β1培養(yǎng)hDPCs 24h后ZEB2m RNA的表達(dá)(×10-4)()
表2 不同濃度TGF-β1培養(yǎng)hDPCs 24h后ZEB2m RNA的表達(dá)(×10-4)()
注:與0ng/ml和20ng/ml對(duì)照組比較,*P<0.05
濃度(ng/ml) 樣本量 ZEB2031.00±0.002.5 3 1.21±0.10532.14±0.09*10 3 1.98±0.1220 3 1.82±0.09
2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示 5ng/ml TGF-β1刺激hDPCs 0-72h,與相同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較,ZEB2 mRNA表達(dá)均有上調(diào)(P<0.05);實(shí)驗(yàn)組中隨時(shí)間增加,ZEB2 mRNA相對(duì)表達(dá)量逐漸上升,24h達(dá)峰值(P<0.05),隨后表達(dá)有所降低,結(jié)果見(jiàn)表3。
表3 5ng/ml TGF-1刺激h DPCs后ZEB2m RNA的表達(dá)(×10-4)()
表3 5ng/ml TGF-1刺激h DPCs后ZEB2m RNA的表達(dá)(×10-4)()
注:與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較,*P<0.05;與0h、72h實(shí)驗(yàn)組比較,#P<0.05
組別 樣本量ZEB2實(shí)驗(yàn)組 對(duì)照組0h 3 1.00±0.01 1.00±0.002h 3 1.18±0.03* 1.03±0.056h 3 1.47±0.05* 1.06±0.1112h 3 1.90±0.04* 1.10±0.0824h 3 2.28±0.04*# 1.17±0.1048h 3 1.87±0.08* 1.14±0.0572h 3 1.72±0.12* 1.15±0.09
2.4 ZEB2在hDPCs中的定位和表達(dá) 如圖2所示,正常hDPCs的胞質(zhì)和胞核內(nèi)均可見(jiàn)較淺的綠色熒光,ZEB2在正常hDPCs中呈弱陽(yáng)性表達(dá),TGF-β1培養(yǎng)24h后,hDPCs中綠色熒光染色變強(qiáng),胞核表達(dá)更為明顯,陰性對(duì)照組未見(jiàn)綠色熒光表達(dá)。
圖2 ZEB2在hDPCs的FISH檢測(cè)(激光共聚焦顯微鏡,×200)
ZEB2/SIP1是ZEB轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員,該基因序列由一個(gè)可變區(qū)域?qū)蓚€(gè)相互獨(dú)立且高度保守的鋅指結(jié)構(gòu)簇連接構(gòu)成,ZEB2的鋅指結(jié)構(gòu)具有特異DNA結(jié)合活性,而可變區(qū)域中的Smad結(jié)合區(qū)域能與Smad基因的功能結(jié)構(gòu)域-MH2結(jié)構(gòu)域(Mad homology 2 domain),結(jié)合并相互作用,參與TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),影響細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生物過(guò)程[4,5]。ZEB2在人外胚層來(lái)源器官包括腦、脊髓、眼、皮膚、心、肝、肺和牙胚等均有表達(dá),Verschueren等[6]研究發(fā)現(xiàn) ZEB2可與 Smad1、Smad2、Smad3及Smad5結(jié)合并相互作用,在Smad介導(dǎo)的TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮一定作用。Lucchini等[6]通過(guò)免疫組化檢測(cè)到人牙髓細(xì)胞中Smad2,Smad3和Smad4蛋白的表達(dá),Smad蛋白是TGF-β受體作用的直接底物,TGF-β信號(hào)與細(xì)胞表面受體TGF-βRI和TGF-βRII結(jié)合,形成三聚體,激活R-Smad(Smad2和Smad3磷酸化)將信號(hào)傳導(dǎo)至胞質(zhì),R-Smad與Co-Smad(Smad4)結(jié)合后,繼而轉(zhuǎn)移至胞核內(nèi)與靶基因結(jié)合調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白合成,使細(xì)胞表型和功能發(fā)生改變。TGF-β/Smad信號(hào)傳導(dǎo)通路中任一環(huán)節(jié)改變均可導(dǎo)致信號(hào)傳導(dǎo)異常,影響TGF-β的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)。
牙髓細(xì)胞是含有成牙本質(zhì)細(xì)胞系干細(xì)胞的特異細(xì)胞群,有一定的增殖和分化能力,較牙髓干細(xì)胞易于獲得,可作為牙髓干細(xì)胞的細(xì)胞代型進(jìn)行研究[7],但牙髓細(xì)胞的分化能力有限,因此提高牙髓細(xì)胞的成牙本質(zhì)分化能力對(duì)促進(jìn)受損牙髓的修復(fù)具有積極意義。TGF-β是誘導(dǎo)成牙本質(zhì)細(xì)胞分化和第三期牙本質(zhì)形成的主要信號(hào)分子,牙本質(zhì)基質(zhì)中存在TGF-β,成牙本質(zhì)細(xì)胞受到刺激或損傷時(shí),可導(dǎo)致牙本質(zhì)基質(zhì)中的TGF-β釋放并作用于成牙本質(zhì)細(xì)胞,促進(jìn)第三期牙本質(zhì)的形成[8,9]。TGF-β有三種異構(gòu)體,TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3,研究發(fā)現(xiàn)牙髓細(xì)胞主要表達(dá)TGF-β1,TGF-β1在牙髓損傷后可反應(yīng)性增加,誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞的成牙本質(zhì)向分化[10]。Kalyva等[11]發(fā)現(xiàn)富含TGF-β1的生物材料促進(jìn)修復(fù)性牙本質(zhì)的形成,表明TGF-β1與成牙本質(zhì)細(xì)胞分化及牙本質(zhì)基質(zhì)分泌的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。Li等[12]研究顯示TGF-β1能誘導(dǎo)細(xì)胞極化和基質(zhì)沉積,致使成牙本質(zhì)樣細(xì)胞的分化和牙本質(zhì)的形成。
本實(shí)驗(yàn)利用FISH檢測(cè)發(fā)現(xiàn)牙髓組織中ZEB2主要表達(dá)于成牙本質(zhì)細(xì)胞,而牙髓細(xì)胞中的表達(dá)呈較弱;FISH檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ZEB2在正常hDPCs胞質(zhì)和胞核內(nèi)呈弱陽(yáng)性表達(dá),提示hDPCs中存在ZEB2的表達(dá),ZEB2可能與hDPCs的成牙本質(zhì)向分化相關(guān)。Berx等[13]研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中,ZEB在腫瘤早期通過(guò)抑制抑癌基因,促使細(xì)胞增殖;腫瘤后期ZEB影響細(xì)胞的極性并誘導(dǎo)其分化。RT-qPCR檢測(cè)ZEB2在不同濃度TGF-β1作用下hDPCs中的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)在0-5ng/ml范圍內(nèi)ZEB2 mRNA的表達(dá)隨濃度增大而逐漸上調(diào),5ng/ml達(dá)最大,10-20ng/ml有下降趨勢(shì),說(shuō)明5ng/ml是最大作用濃度,以5ng/ml TGF-β1刺激hDPCs 0-72h,與培養(yǎng)相同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較,ZEB2 mRNA表達(dá)均有上調(diào);實(shí)驗(yàn)組ZEB2 mRNA在TGF-β1刺激0-24h過(guò)程中表達(dá)逐漸上調(diào),24h達(dá)到高峰,后隨時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)有所降低,提示TGF-β1促進(jìn)hDPCs中ZEB2的表達(dá),TGF-β1刺激下hDPCs中ZEB2 mRNA的表達(dá)可能與TGF-β1受體、TGF-β1的細(xì)胞毒性以及其他基因和通路的相互影響有關(guān)。Shiba等[14]報(bào)道TGF-β1的作用效應(yīng)不僅與其濃度、作用時(shí)相有關(guān),而且與細(xì)胞類型、生長(zhǎng)狀態(tài)也有關(guān)系,TGF-β1與細(xì)胞膜上相應(yīng)的受體數(shù)量有關(guān),當(dāng)TGF-β1與其相應(yīng)受體結(jié)合達(dá)到飽和后,即使再增加濃度也不能增強(qiáng)其作用;另外,也可能與不同細(xì)胞不同生長(zhǎng)狀態(tài)分泌生長(zhǎng)因子的效能有關(guān),隨細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖加快,細(xì)胞密度增大,細(xì)胞的分泌作用增強(qiáng),外源性生長(zhǎng)因子的作用反而不顯著。TGF-β1信號(hào)的傳導(dǎo)受到機(jī)體嚴(yán)密的調(diào)控,并與其他基因或信號(hào)通路存在交叉作用。Gregory等[15]研究發(fā)現(xiàn)在侵襲性乳腺導(dǎo)管癌中,ZEB、TGF-β與miR-200三者間可形成反饋環(huán)路,ZEB與TGF-β 的表達(dá)呈正相關(guān),ZEB、TGF-β 與miR-200的表達(dá)呈負(fù)相關(guān),促進(jìn)腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移。Burk等[16]發(fā)現(xiàn)ZEB能負(fù)性調(diào)節(jié)miR-141和miR-200c的表達(dá),miR-141通過(guò)抑制TGF-β下調(diào)ZEB的表達(dá),miR-200抑制ZEB轉(zhuǎn)錄因子活性,TGF-β能通過(guò)下調(diào)miR-200家族成員誘導(dǎo)ZEB蛋白的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)TGF-β1促進(jìn)ZEB2表達(dá),這與Gregory、Burk等的研究結(jié)果相符。FISH檢測(cè)觀察到ZEB2在5ng/ml TGF-β1刺激24h后的hDPCs中表達(dá)變強(qiáng),且胞核表達(dá)更為明顯,提示TGF-β1刺激可能引起ZEB2由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核,目前對(duì)于ZEB2在細(xì)胞中定位的研究尚不明確,已有研究表明轉(zhuǎn)錄因子在胞核胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位可作為一項(xiàng)重要的細(xì)胞調(diào)節(jié)機(jī)制[17]。以上研究提示ZEB2可能參與TGF-β1信號(hào)途徑調(diào)控牙髓細(xì)胞的成牙本質(zhì)向分化過(guò)程。
綜上,本研究發(fā)現(xiàn)ZEB2在牙髓組織中主要表達(dá)于成牙本質(zhì)細(xì)胞,TGF-β1刺激hDPCs后,ZEB2的表達(dá)上調(diào)且由胞質(zhì)向胞核轉(zhuǎn)位,提示ZEB2可能參與TGF-β1在成牙本質(zhì)向分化的調(diào)控作用,為闡明TGF-β1/Smad信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)理提供新線索,但其在細(xì)胞中的作用機(jī)制需進(jìn)一步探索。
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