韓 雪 劉洪臣 王東勝 鄂玲玲 吳 霞 周 威

種植牙修復(fù)缺失牙不僅恢復(fù)了咀嚼功能，美觀效果也可與真牙媲美，已經(jīng)成為口腔醫(yī)學(xué)界和缺牙患者的首選。拔牙后即刻種植的優(yōu)點有：(1)縮短了修復(fù)時間；(2)即刻種植修復(fù)極大限度保留了骨組織和軟組織外形；(3)可獲得理想的植入位置和角度，使齦乳頭外形大小達(dá)到更理想的美學(xué)效果。然而，由于拔牙窩形態(tài)不規(guī)則，種植體與牙槽骨之間存在的空隙影響種植體的初期穩(wěn)定性。有研究表明，如果空隙大于1mm，種植體-骨的結(jié)合率就會明顯減小[1]。近年來，組織工程骨為骨缺損的修復(fù)治療另辟蹊徑。由于拔牙窩形態(tài)的不規(guī)整性，利用可注射組織工程骨能極大滿足即刻種植體周圍不規(guī)則的骨缺損。以往的研究表明，納米羥基磷灰石/膠原/硫酸鈣復(fù)合材料(nHAC/CSH)與天然骨的組成和空間結(jié)構(gòu)極其相似，具有良好的生物相容性和生物活性[2]。外周血基質(zhì)細(xì)胞(Peripheral blood-acquired mesenchymal progenitorcells，BMPC)易于獲得，與骨髓基質(zhì)細(xì)胞在表征上有許多共同點，同樣具有高度自我更新和多向分化的能力[3]。本實驗即以nHAC/CSH作為犬BMPC的支架載體，將nHAC/CSH-dBMPC復(fù)合物注射到犬即刻種植體周圍，觀察體內(nèi)成骨能力，探討可注射組織工程骨修復(fù)即刻種植體周圍骨缺損的可行性。

1.材料和方法

1.1 主要試劑和設(shè)備 L-DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司，美國)，β-甘油磷酸鈉、地塞米松、抗壞血酸(Sigma公司，美國)，淋巴細(xì)胞分離液(天津灝洋生物制品有限公司)，胰酶(Amresco公司，美國)，納米羥基磷灰石/膠原/硫酸鈣(北京奧精生物科技有限公司)，Ti2448合金(中科院金屬研究所提供)。

超凈工作臺(北京昌平凈化設(shè)備廠)，CO2恒溫孵箱(Thermo Forma公司，美國)，倒置相差顯微鏡(Leica公司，德國)，E300CP硬組織切片機(jī)(Exakt，德國)，SUNITM種植機(jī)(Satelec，法國)。

1.2 實驗動物 成年雄性雜種犬4只，體重約15kg(由解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供并飼養(yǎng))。

1.3 方法

1.3.1 犬BMPC的獲取和培養(yǎng)[4]健康成年犬，肝素化注射器穿刺入前臂靜脈抽血，約15-20mL，用等量L-DMEM培養(yǎng)基稀釋，緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液表面，離心20min收集中間云霧狀的單個核細(xì)胞帶，清洗3次，以5×106/mL密度接種于6孔板，培養(yǎng)液為含10%FBS的L-DMEM，置37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)，每隔3天進(jìn)行換液。原代培養(yǎng)至貼壁細(xì)胞生長近融合后，胰蛋白酶消化，按1：2比例進(jìn)行接種，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)基一次，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長增殖情況以及形態(tài)變化。

1.3.2 犬BMPC的成骨誘導(dǎo)分化 取第3代細(xì)胞，加入含10-8mol/L地塞米松，10mmol/L β-甘油磷酸鈉，50μg/mL抗壞血酸的成骨誘導(dǎo)液。培養(yǎng)14天后，進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察I型膠原表達(dá)情況；培養(yǎng)28d，茜素紅染色觀察鈣結(jié)節(jié)形成情況。

1.3.3 nHAC/CSH-dBMPC可注射骨的制備 dBMPC成骨誘導(dǎo)2周后，調(diào)整細(xì)胞濃度達(dá)2×106/mL，取0.8ml細(xì)胞懸液，與1g nHAC/CSH均勻混合，形成糊狀復(fù)合物。

1.3.4 植入試驗 全麻消毒鋪巾后，拔除犬雙側(cè)下頜第二、三、四前磨牙，并在拔牙創(chuàng)遠(yuǎn)中制備4mm×5mm×6mm箱狀骨缺損，植入圓柱形種植體(直徑3.0mm、高10.0mm)，種植體骨缺損區(qū)進(jìn)行不同處理，空白對照組(control組)：不植入任何材料；單純材料組(nHAC/CSH組)：植入nHAC/CSH；可注射骨組(nHAC/CSH-dBMPC組)：植入nHAC/CSH-dBMPC可注射骨。植入后覆蓋Bio-guid膜，嚴(yán)密縫合創(chuàng)口。術(shù)后3d每日肌注青霉素160萬U，流食2d，軟食2周，口內(nèi)縫線任其自行脫落。

1.3.5 取材與觀察 術(shù)后12周處死動物取材，固定，甲基丙烯酸甲酯包埋，用E300CP型硬組織切片機(jī)及特制夾具，沿種植體長軸切開，將帶種植體的骨組織修切成組織塊，手工制作20μm厚的磨片[5]，經(jīng)亞甲基藍(lán)染色后光學(xué)顯微鏡下觀察種植體周圍骨缺損區(qū)的骨愈合情況。

2.結(jié)果

2.1 dBMPC向成骨細(xì)胞誘導(dǎo) 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)14d，I型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性，胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色的顆粒，胞核不著色(圖1)。培養(yǎng)28d左右茜素紅染色呈紅色斑塊，為鈣鹽特征性染色(圖 2)。

圖1 成骨誘導(dǎo)14d，犬BMPC I型膠原陽性表達(dá)(×100)

圖2 成骨誘導(dǎo)28d，犬BMPC形成的鈣結(jié)節(jié)(×100)

2.2 大體觀察 實驗犬均存活至取材，傷口愈合良好，種植體無脫落，周圍無紅腫和免疫排斥反應(yīng)。

2.3 組織學(xué)觀察 術(shù)后12周，空白組種植體周圍骨缺損區(qū)已見新生骨小梁形成，種植體周圍僅為少量直接接觸的編織骨，骨小梁細(xì)小(圖3A)，骨結(jié)合率為18.271±2.15%；nHAC/CSH組種植體周圍直接接觸的骨組織較多，可見骨小梁較空白組粗大(圖 3B)，骨結(jié)合率為 33.131±7.29%；nHAC/CSH-dBMPC組種植體界面可見大量直接接觸的骨組織，界面密合，無纖維組織和空隙存在，皮質(zhì)骨處可見哈佛氏系統(tǒng)生成，骨結(jié)合率為65.031±3.13%(圖3C)。三組之間骨結(jié)合率有顯著性差異(圖 4)。

3.討論

近年來，隨著干細(xì)胞研究的重大進(jìn)展及應(yīng)用材料的完善和發(fā)展，利用骨組織工程方法構(gòu)建良好骨替代物己成為極具臨床應(yīng)用前景的研究熱點。種子細(xì)胞的獲取、培養(yǎng)和支架材料的選擇，是組織工程骨研究的關(guān)鍵性環(huán)節(jié)。CD14+成纖維細(xì)胞可以從人外周血單核細(xì)胞原代培養(yǎng)出來，和骨髓間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞在表征上有許多共同點，同樣具有高度自我更新和多向分化的能力[6]。本實驗利用密度梯度離心法并結(jié)合貼壁分離篩選法來分離純化犬外周血基質(zhì)細(xì)胞。

圖3 術(shù)后12周的亞甲基藍(lán)染色結(jié)果

圖4 三組骨結(jié)合率(*P＜0.05%)

本實驗培養(yǎng)的犬BMPC經(jīng)成骨誘導(dǎo)后能使鈣離子以鈣鹽的方式在細(xì)胞外面沉積下來，形成鈣結(jié)節(jié)，茜素紅和鈣發(fā)生顯色反應(yīng)，鈣結(jié)節(jié)也就被染成了深紅色，茜素紅染色陽性，同時I型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性，證明該細(xì)胞具有向成骨分化的能力，可作為可注射組織工程骨的種子細(xì)胞。

理想的骨修復(fù)材料是應(yīng)具有可降解性、可以被宿主的新骨完全替代[7]。隨著微創(chuàng)外科理論和技術(shù)的成熟，支架材料的研究熱點集中于可注射材料的發(fā)展。可注射組織工程生物材料除了要求具有一般生物材料的特性：良好的生物相容性及組織相容性，具有生物可降解性，無毒、無不良反應(yīng)，來源充足，性質(zhì)穩(wěn)定，易貯存等特點以外，還必須具有以下特征：(1)一定的流動性；(2)可靠的成骨效應(yīng)；(3)工藝簡單[8]。

硫酸鈣是一種無機(jī)化合物，屬多功能硬性膠凝材料。硫酸鈣用作骨缺損填充修復(fù)材料已經(jīng)達(dá)百年之久，其具有良好的生物相容性，已得到眾多實驗的證實[9-11]。硫酸鈣根據(jù)其結(jié)合水分子量的多少,可分為二水硫酸鈣、半水硫酸鈣和無水硫酸鈣三種形式，其中，因半水硫酸鈣具有更好的強(qiáng)度及降解性能，常被作為骨移植替代材料。由α結(jié)晶技術(shù)改造的手術(shù)級半水硫酸鈣顆粒，無毒，異物反應(yīng)小，骨膜存在下有成骨效應(yīng)，可生物降解。同時具有良好的微孔性，可加載干細(xì)胞、成骨細(xì)胞、生物因子或化療藥物，并能有效地阻止軟組織向缺損部位生長[12]。

基于仿生學(xué)原理的納米羥基磷灰石膠原(Nano-sized hydroxyapatite/collagen，n-HAC)由于晶體尺度與天然骨接近，是與天然骨的成分和空間結(jié)構(gòu)極其相似的礦化纖維，具有降解與新骨生長匹配，接近自體骨框架，可供成骨細(xì)胞貼附生長增殖等優(yōu)點，已有大量的研究證明其具有良好的生物活性和生物相容性。為了避免單用一種材料的缺陷，提高硫酸鈣的骨再生性能，清華大學(xué)材料科學(xué)與工程系將兩種具有互補(bǔ)特征的可降解材料按一定方式組合，變成可注射性的骨水泥，凝固時間適當(dāng)，約20min，可用于骨再生的應(yīng)用[2]。和純硫酸鈣相比，添加nHAC能使復(fù)合材料的凝固時間延長，顯著提高其可注射性能；更重要的是，nHAC/CSH在模擬體液浸泡后可以誘導(dǎo)產(chǎn)生類骨磷灰石，說明添加nHAC顯著改善了復(fù)合材料的生物活性。Liu[2]將該材料植入兔皮下及下頜骨臨界性缺損處進(jìn)行皮內(nèi)反應(yīng)實驗和骨缺損修復(fù)實驗，未見紅斑及水腫，nHAC/CSH使兔下頜骨缺損區(qū)完全長平。

本實驗將nHAC/CSH作為犬BMPC的支架載體，將nHAC/CSH-dBMPC復(fù)合物注射到犬即刻種植體周圍，組織學(xué)觀察顯示：空白組種植體周圍骨缺損區(qū)已見新生骨小梁形成，種植體周圍僅為少量直接接觸的編織骨，骨小梁細(xì)??；nHAC/CSH組種植體周圍直接接觸的骨組織較多，可見骨小梁較空白組粗大；nHAC/CSH-dBMPC組種植體界面可見新生骨組織。統(tǒng)計學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)nHAC/CSH-dBMPC、nHAC/CSH和空白組的BIC存在顯著性差異。

本實驗的研究結(jié)果證明了以dBMPC為種子細(xì)胞，nHAC/CSH為支架材料構(gòu)建的組織工程化骨本身具有成骨活性，可在種植體周圍形成新骨，使種植體與組織工程化骨之間形成骨性結(jié)合界面。其原因在于nHAC/CSH材料在體內(nèi)局部pH值降低，導(dǎo)致周圍骨質(zhì)脫礦缺損，從而導(dǎo)致BMP-2的釋放，刺激骨質(zhì)生成[13]；nHAC能聚集更多蛋白質(zhì)，誘導(dǎo)細(xì)胞粘附和增殖[14,15]，為細(xì)胞成分的生長、細(xì)胞外基質(zhì)的分泌、血管成分的長入提供了理想的條件。還可能與dBMPC具有向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的特性，在體內(nèi)種植體周圍成骨細(xì)胞和成骨前體細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子的作用下，dBMPC向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，促進(jìn)血運重建，為組織工程血管化提供條件。

綜上所述，在本實驗中，我們通過將nHAC/CSH-dBMPC復(fù)合體成功用于修復(fù)犬下頜骨即刻種植體周圍骨缺損，初步評估了這種新型的可注射骨組織工程復(fù)合體在骨缺損修復(fù)治療中的潛在價值，為骨組織工程復(fù)合體的構(gòu)建以及應(yīng)用開辟了一條新的途徑。

[1]Akimoto K,Becker W,Persson R,et al.Evaluation of titanium implants placed into simulated extraction sockets:a study in dogs[J].The International journal of oral&maxillofacial implants,1999,14(3):351-360

[2]Liu HY,Liu X,Zhang LP,et al.Improvement on the performance of bone regeneration of calcium sulfate hemihydrate by adding mineralized collagen[J].Tissue engineering Part A,2010,16(6):2075-2084

[3]韓 雪,劉洪臣.外周血多潛能間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞在骨組織工程中的應(yīng)用進(jìn)展[J].國際口腔醫(yī)學(xué)雜志,2011,38(1):71-74

[4]韓 雪,劉洪臣,王東勝,等.犬外周血基質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)及其橫向分化潛能研究[J].中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志,2010,8(3):133-136

[5]王東勝,路正剛.種植體骨界面組織形態(tài)學(xué)研究方法探討[J].中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志,2005,3(3):142-144

[6]Seta N,Kuwana M.Derivation of multipotent progenitors from human circulating CD14+monocytes[J].Experimental hematology,2010,38(7):557-563

[7]Yoshikawa H,Myoui A.Bone tissue engineering with porous hydroxyapatite ceramics[J].J Artif Organs,2005,8(3):131-136

[8]黃若昆,林月秋.可注射性骨組織工程載體研究進(jìn)展[J].中國矯形外科雜志,2007,19(9):681-683

[9]Sidqui M,Collin P,Vitte C,et al.Osteoblast adherence and resorption activity of isolated osteoclasts on calcium sulphate hemihydrate[J].Biomaterials,1995,16(17):1327-1332

[10]Nilsson M,Wang JS,Wielanek L,et al.Biodegradation and biocompatability of a calcium sulphate-hydroxyapatite bone substitute[J].The Journal of bone and joint surgery British volume,2004,86(1):120-125

[11]Winn SR,Hollinger JO.An osteogenic cell culture system to evaluate the cytocompatibility of Osteoset,a calcium sulfate bone void filler[J].Biomaterials,2000,21(23):2413-2425

[12]鈕心剛,嚴(yán)力生,張紅梅,等.可注射硫酸鈣/羥基磷灰石復(fù)合物作為經(jīng)皮椎體成形術(shù)填充物的實驗研究[J].生物骨科材料與臨床研究,2010,7(1):1-7

[13]Walsh WR,Morberg P,Yu Y,et al.Response of a calcium sulfate bone graft substitute in a confined cancellous defect[J].Clinical orthopaedics and related research,2003(406):228-236

[14]Li X,Gao H,Uo M,et al.Effect of carbon nanotubes on cellular functions in vitro[J].Journal of biomedical materials research Part A,2009,91(1):132-139

[15]Li X,van Blitterswijk CA,Feng Q,et al.The effect of calcium phosphate microstructure on bone-related cells in vitro[J].Biomaterials,2008,29(23):3306-3316