宮語晨，許崇利，錢愛東*，許崇波

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，長春130118;2.吉林化工學院化工與生物技術學院，吉林吉林132022;3.大連大學醫(yī)學院，遼寧大連116622)

A型魏氏梭菌(Clostridium welchii type A)是引起人畜創(chuàng)傷性氣性壞疽的主要病原菌之一，該菌主要致病因子是α毒素。α毒素是由370個氨基酸組成的單鏈多肽，是一種依賴于鋅離子具有磷脂酶C(PLC)活性的金屬酶，它能水解細胞膜的磷脂酰膽堿，破壞細胞膜完整性，導致細胞裂解，從而具有細胞毒性、溶血性、致死性和皮膚壞死性等特性［1-3］。α毒素具有酶分子的結構特征，其活性部位包括催化位點和結合位點。α毒素的第56位天冬氨酸(Asp-56)是鋅離子的結合位點，又是α毒素的磷脂酶C催化位點，α毒素Asp-56對其具有生物學活性至關重要［4-6］。但關于α毒素Asp-56突變前后的生物學活性和分子結構的變化以及二者之間的關系尚不清楚。為此，本實驗選擇影響α毒素磷脂酶C活性第56位Asp-56進行定點突變，開展α毒素Asp-56突變前后分子結構和生物學活性的研究，為今后研究α毒素分子結構對其生物學活性的影響以及α毒素的作用機制奠定基礎，同時為下一步研制α毒素基因工程亞單位疫苗提供候選工程菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體、菌種和實驗動物 表達載體pET-32a和受體菌E.coli BL21(DE3)均購自Novagen公司;含α毒素基因的重組質(zhì)粒pXETA02由大連大學許崇波教授惠贈［7］;昆明系小鼠購自吉林大學農(nóng)學部實驗動物中心，16～18 g，雌雄各半。

1.1.2 試劑 Ex Taq PCR試劑盒、限制性核酸內(nèi)切酶 (BamH I、EcoR I、Nco I)、QDL2000 DNA Marker和IPTG均購自寶生物工程(大連)有限公司;Wizard PCR preps DNA Purification System、T4DNA連接酶購自Promega公司;瓊脂糖為Biowest公司產(chǎn)品;卡那霉素、氨芐青霉素購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 α毒素D56G突變體基因PCR引物的設計與合成 根據(jù)A型魏氏梭菌α毒素基因序列［8］，設計α毒素D56G突變體基因PCR引物:引物P1:5’-CATGCCATGGCAATGAAAAGAAAGATTTGT-3’，引物 P2:5’-TGGATAAG TAGAACCTAATTG-3’，引物 P3:5’-GGTTATGATAAGAATGCATAT-3’(突變引物)，引物 P4:5’-CCGGAATTCTTTTATATTATAAGTTGAATT-3’，引物 P1含有 Nco I限制性內(nèi)切核酸酶堿基(斜體部分)和保護性堿基，引物P4含有EcoR I限制性內(nèi)切核酸酶堿基(斜體部分)和保護性堿基，引物P3為含有突變堿基的突變引物，PCR引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

PCR 體 系 (50 μL):10 × PCR buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 5 μL，模板pXETA02 DNA 1 μL，引物 P1 和 P2(0.1 μmol/L)各1 μL，ddH2O 36 μL，Ex Taq DNA 聚合酶(2.5 U/μL)1 μL。

PCR條件:95℃ 5 min;95℃ 60 s，55℃ 60 s，72℃ 60 s，共30個循環(huán);72℃ 10 min。

1.2.2 α毒素D56G基因的定點突變與重組表達質(zhì)粒pM-D56G的構建 用引物P1和P2從模板pXETA02質(zhì)粒中擴增0.26 kb基因片段，再用引物P3和P4從模板pXETA02質(zhì)粒中擴增0.94 kb基因片段，回收二者的PCR片段，用T4DNA連接酶連接，然后以連接產(chǎn)物為模板，用引物P1和P4再進行擴增，即可得到帶有突變位點的1.2 kb α毒素D56G突變體基因，最后進行酶切鑒定和核苷酸序列測定［9］。

1.2.3 重組菌株BL21(DE3)(pM-D56G)在大腸桿菌中的誘導表達及包涵體變性與復性 參照文獻［10-11］，將 250 mL 重組菌株 BL21(DE3)(pMD56G)培養(yǎng)液在4℃于7000 r/min離心10 min，棄掉上清的菌體，用 50 mL緩沖液［20 moL/L Tris-HCl(pH 8.0)］懸浮混勻，在4℃于7000 r/min離心10 min。重復洗滌菌體一次。用300 mL緩沖液［1 moL/L Tris-HCl(pH 8.0)］懸浮混勻菌體，然后于冰水浴中進行超聲波破碎。超聲波破碎菌體的條件是:功率400 W，超聲5 s，間歇5 s，共45 min。超聲波破碎菌體結束后，在4℃ 10000 r/min離心30 min，棄掉上清的沉淀物用洗滌液［20 mmoL/L Tris-HCl(pH 8.0)，0.5 moL/L尿素］懸浮混勻。重復洗滌沉淀物一次，再用500 mL洗滌液重懸沉淀，所得產(chǎn)物即為包涵體。

按照變性液與包涵體1∶40的比例，加入變性液［20 mmoL/L Tris-HCl(pH 8.0)，8 moL/L 尿素，0.1% β-巰基乙醇］，迅速重懸包涵體，于37℃ 變性2 h，然后在4℃ 12000 r/min離心10 min。把上清液移入處理過的透析袋并密封后，放進已加入150 mL復性液［20 mmoL/L Tris-HCl(pH 8.0)，尿素濃度梯度分別為 6、4、2、0 moL/L］的燒杯中開始進行梯度透析復性。間隔6 h更換一次復性液，復性后的包涵體蛋白放入離心管中，4℃保存?zhèn)溆茫?0-11］。包涵體蛋白的SDS-PAGE分析按文獻［9］介紹的方法進行。

1.2.4 α毒素及α毒素D56G突變體蛋白分子二級結構的預測 按照Geourjon介紹的SOPMA法，在EXPASY服務器(http://www.expasy.org/tools)進行預測α毒素和α毒素D56G突變體蛋白分子的二級結構［12］。

1.2.5 α毒素及α毒素D56G突變體蛋白分子3D結構的預測 以蛋白質(zhì)結構數(shù)據(jù)庫(PDB)解析的A型魏氏梭菌α毒素的三維結晶結構(3D)為模板，利用EXPASY服務器(http://www.expasy.org/swissmod/SWISS-MODEL.html)同源模型構建α毒素和α毒素D56G突變體蛋白分子的3D結構，并用Rasmol分析軟件繪制其3D結構圖［13］。

1.2.6 α毒素及α毒素D56G突變體蛋白圓二色光譜分析 采用J810-150S型圓二色(CD)光譜儀，在25℃恒溫下，將0.6 mL蛋白溶液(10 μmol/L)置于光徑為0.1 cm比色杯中，掃描范圍190～250 nm，狹縫寬度1 nm，掃描速度50 nm/min，響應時間2 s，掃描次數(shù)3次。測定α毒素和α毒素D56G突變體蛋白的CD光譜并記錄數(shù)據(jù)［10］。

1.2.7 重組菌株BL21(DE3)(pM-D56G)生物學活性的測定 將構建的重組菌株(BL21(DE3)(pMD56G)培養(yǎng)上清、菌體、菌體裂解物和A型魏氏梭菌標準株C57-1的培養(yǎng)上清分別接種卵黃瓊脂平板和血瓊脂平板上，觀察有無磷脂酶C活性和溶血活性［14］。另外，取 3 只 0.5 mL Eppendorf管，各加入100 μL卵黃(含卵磷脂)稀釋液，再分別加入100 μL α毒素、α毒素D56G突變體蛋白、生理鹽水，混勻后，于37℃孵育24 h，觀察是否有渾濁環(huán)出現(xiàn)，檢測磷脂酶C活性［10］。

取80只小鼠，隨機分組，每組20只，分別經(jīng)口服或腹腔注射5×109個A型魏氏梭菌標準株C57-1和重組菌株(BL21(DE3)(pM-D56G)，觀察癥狀和病理變化［14］。

1.2.8 抗原制備及免疫攻毒試驗 重組菌株(BL21(DE3)(pM-D56G)經(jīng)IPTG誘導4 h后離心收集菌體，然后重懸于5 mL 50 mmol/L Tris-HCl-2 mmol/L EDTA中，加入溶菌酶至終濃度100 μg/mL，再加入5 mL 1%TritonX-100，于30℃溫育15 min。超聲波處理2個10 s，然后12000 r/min離心15 min，收集的沉淀物即為包涵體粗提物，將其10倍稀釋后，加入氫氧化鋁膠至10%，作為免疫用抗原［14］。

取160只小鼠，隨機分為2組，每組80只，一組用包涵體抗原腹腔免疫0.5 mL/只，另一組用A型魏氏梭菌標準株C57-1類毒素0.5 mL/只，間隔14 d后，以上述方法進行第二次免疫，14 d后進行攻毒試驗。同時設立生理鹽水對照組。將過夜培養(yǎng)的A型魏氏梭菌標準菌C57-1培養(yǎng)上清作倍比稀釋，每個劑量腹腔注射小鼠6只，觀察小鼠死亡情況;用1MLD A型魏氏梭菌標準株C57-1培養(yǎng)上清攻擊免疫小鼠，觀察小鼠存活情況［14］。

2 結果與分析

2.1 α毒素D56G突變基因的擴增與表達質(zhì)粒pMD56G的構建 利用PCR定點突變技術，擴增出帶有突變位點的1.2 kb A型魏氏梭菌α毒素D56G突變體基因，并將其插入到表達載體pET-32a上，構建了含α毒素D56G突變基因表達質(zhì)粒的重組菌株BL21(DE3)(pM-D56G)。經(jīng)Nco I/EcoR I、BamH I/EcoR I和Nco I/BamH I/EcoR I酶切鑒定和序列測定，結果表明，構建的重組表達質(zhì)粒pMD56G含有α毒素D56G突變體基因(圖1)，而且編碼α毒素第56位Asp的密碼子GAT已經(jīng)突變成編碼Gly的密碼子GGT，成功地構建了α毒素D56G突變體基因并準確實施了預期的定點突變。

2.2 α毒素D56G突變體基因表達產(chǎn)物的SDSPAGE分析 含A型魏氏梭菌α毒素D56G突變體基因的重組菌株BL21(DE3)(pM-D56G)用IPTG誘導4 h后，SDS-PAGE分析結果表明，α毒素D56G突變體基因在受體菌BL21(DE3)中得到較高水平的表達。經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)掃描分析，重組菌株BL21(DE3)(pM-D56G)中的α毒素D56G突變體蛋白表達量占菌體總蛋白相對含量的22.48%(圖2)。

圖2 重組菌株BL21(DE3)(pM-D56G)表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

2.3 α毒素及α毒素D56G突變體蛋白分子二級結構預測 α毒素和α毒素D56G突變體蛋白分子二級結構預測的結果顯示，α毒素蛋白含α螺旋118個 (31.9%)、β折疊78個 (21.1%)、β轉(zhuǎn)角44個 (11.9%)、無規(guī)則卷曲130個 (35.1%)，α毒素D56G突變體含α螺旋118個 (31.89%)、β折疊78個 (21.08%)、β轉(zhuǎn)角46個 (12.43%)、無規(guī)則卷曲128個 (34.60%)(圖3)。從預測的α毒素及α毒素D56G突變體蛋白分子的二級結構結果來看，二者的二級結構除第56突變位點由無規(guī)則卷曲變成β轉(zhuǎn)角和第55位由無規(guī)則卷曲變成β轉(zhuǎn)角外，其余的二級結構沒有發(fā)生變化，說明α毒素和α毒素D56G突變體蛋白分子的二級結構基本一致。

2.4 α毒素及α毒素D56G突變體蛋白分子3D結構預測 α毒素和α毒素D56G突變體蛋白分子3D結構的預測結果顯示，α毒素一共有10段α螺旋，8段β折疊，而α毒素D56G突變體蛋白的3D結構與α毒素的3D結構相似(圖4)。

2.5 α毒素及α毒素D56G突變體蛋白分子的圓二色光譜分析 圓二色(CD)光譜儀測定了α毒素及α毒素D56G突變體蛋白分子的CD光譜，結果顯示，α毒素分別在207 nm和209 nm處有一個凹峰，而α毒素D56G突變體蛋白則沒有(圖5 A、B，表1)。

圖3 α毒素和α毒素D56G突變體蛋白分子的二級結構預測及比較

圖4 α毒素(A)和α毒素D56G突變體蛋白(B)分子3D結構預測

圖5 α毒素(A)及α毒素D56G突變體蛋白(B)的圓二色譜圖

表1 圓二色譜測定α毒素和α毒素D56G突變體蛋白二級結構成分比較

2.6 重組菌株BL21(DE3)(pM-D56G)生物學活性的測定 將重組菌株BL21(DE3)(pM-D56G)的培養(yǎng)上清、菌體培養(yǎng)物及菌體裂解物涂布于卵黃瓊脂平板上，結果重組菌株的培養(yǎng)上清、菌體培養(yǎng)物、菌體裂解物均沒有出現(xiàn)渾濁環(huán)，表明α毒素D56G突變體蛋白沒有磷脂酶C活性，而對照組的A型魏氏梭菌標準株C57-1培養(yǎng)上清在卵黃瓊脂平板上出現(xiàn)了渾濁環(huán)，這說明重組菌株BL21(DE3)(pM-D56G)不具備α毒素的磷脂酶C活性。磷脂酶C活性檢測結果如圖6所示:1號管出現(xiàn)渾濁環(huán)，而2號和3號管均未出現(xiàn)渾濁環(huán)。結果說明2號管α毒素D56G突變體蛋白和3號管生理鹽水均不能分解卵黃中的卵磷脂，故不具有磷脂酶C活性;1號管α毒素出現(xiàn)渾濁環(huán)，說明α毒素能分解卵黃中的卵磷脂，具有磷脂酶C活性。上述試驗結果證實，重組菌株BL21(DE3)(pM-D56G)表達的α毒素D56G突變體蛋白已經(jīng)喪失了α毒素的磷脂酶C活性。

圖6 磷脂酶C活性檢測結果

將重組菌株BL21(DE3)(pM-D56G)的培養(yǎng)上清、菌體培養(yǎng)物、菌體裂解物涂布于血瓊脂平板上，結果重組菌株的培養(yǎng)上清、菌體培養(yǎng)物、菌體裂解物均沒有出現(xiàn)溶血環(huán)，表明α毒素D56G突變體蛋白沒有溶血作用，而陽性對照組的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌標準株C57-1培養(yǎng)上清在血瓊脂平板上出現(xiàn)了溶血環(huán)，陰性對照組的BL21(DE3)(pET-32a)培養(yǎng)上清在血瓊脂平板上沒有出現(xiàn)溶血環(huán)，這說明重組菌株BL21(DE3)(pM-D56G)不具備α毒素的溶血活性。另外，經(jīng)腹腔注射或口服兩種途徑接種重組菌株BL21(DE3)(pM-D56G)3周后，小鼠全部存活且無異常表現(xiàn)，剖檢觀察無病理變化，表明該菌株喪失了α毒素毒性和致病性;而A型魏氏梭菌標準株C57-1陽性對照組則出現(xiàn)典型的臨床癥狀和病理變化，BL21(DE3)(pET-32a)陰性對照組則無任何變化。

2.7 免疫攻毒試驗 免疫攻毒試驗結果表明，重組菌株BL21(DE3)(pM-D56G)包涵體抗原免疫組保護率為92.5%(74/80)，A型魏氏梭菌標準株C57-1類毒素抗原免疫組保護率為95%(76/80)，而生理鹽水對照組20只小鼠全部死亡，這說明構建的α毒素D56G突變體蛋白具有較好的免疫保護效果。

3 討論

A型魏氏梭菌的主要致病因子是菌體產(chǎn)生的α毒素，由于α毒素能水解卵磷脂的C鏈，產(chǎn)生磷酰膽堿和甘油二脂，故又稱為磷脂酶C(Phospholipase C，PLC)。

α毒素的某些氨基酸組成對其生物學活性有著重要的影響，其中個別氨基酸對其生物活性起著十分重要作用。Nagaham等［15］利用定點突變技術，研究了組氨酸殘基在α毒素中的作用，他們將第68位組氨酸殘基(His)突變成甘氨酸殘基(Gly)，結果突變的α毒素完全喪失了α毒素本身的磷脂酶C活性、鞘磷脂酶活性和溶血活性。如果將第126位、136位His突變成Gly，結果突變的α毒素活性比天然α毒素活性下降100倍。Guillouard等［16］將α毒素第56位Asp突變成 Asn，Nagahama等［17］將第56 位的 Asp 突變成 Ser、Asn、Glu 或 Gln，結果都證實這些α毒素突變體完全喪失了α毒素的溶血性和PLC活性。研究還表明，第56位的Asp是α毒素活性的催化位點，第130位Asn是α毒素活性的結合位點。另外該研究小組還研究了α毒素氨基端酶活位點附近57和65位Tyr的作用，將以上位點用Ala、Leu或Phe突變后，沒有影響鞘磷脂酶的活性。然而將兩個突變體毒素結合到脂質(zhì)體上，并用環(huán)境敏感熒光基團標記后追蹤，發(fā)現(xiàn)其存在于雙分子層疏水區(qū)，說明第57位和第65位的Tyr在α毒素滲透進雙分子膜和鞘磷脂催化位點過程中起著重要作用，但不參與酶活反應［18］。上述研究都說明α毒素的某些氨基酸殘基對其生物學活性至關重要，但都尚未開展α毒素突變體分子結構的研究。

本研究選擇α毒素磷脂酶C上鋅離子的結合位點第56位天冬氨酸(Asp-56)進行定點突變，構建了在大腸桿菌中較高水平表達的α毒素D56G突變體基因，并測定了α毒素D56G突變體蛋白的二級結構、3D結構和圓二色(CD)光譜，同時檢測了其生物學活性，進而探討了α毒素突變前后分子結構和生物學活性的變化，結果表明突變前后α毒素的二級結構和CD光譜都發(fā)生了變化，但卻具有免疫原性，這為進一步研究α毒素的分子結構與生物學功能的關系奠定了基礎，同時為下一步研制α毒素基因工程亞單位疫苗提供了候選基因工程菌株。

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