董曉慶，張東鳴* ，曲桂娟，陳玉珂，王清濱，郭 瑋，王秋舉，楊翼羽

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，吉林長春130118;2.吉林省畜牧總站，吉林長春130062)

抗菌肽是植物、昆蟲、魚、蝦、貝類等防御系統(tǒng)的主要成分之一，具有高效的抗菌活性，對部分病毒也有抑制作用［1－2］，對真核細胞幾乎沒有作用［3］，被認為是天然免疫的重要介質(zhì)。大口黑鱸(Microptorus salmonoides)又名加州鱸，原產(chǎn)于美洲地區(qū)，為肉食性溫水魚類。其肉質(zhì)鮮美、生長快、經(jīng)濟價值較高。近年來，大口黑鱸養(yǎng)殖馴化發(fā)展迅速，但對大口黑鱸的免疫機制了解甚少，直接制約了大口黑鱸養(yǎng)殖的免疫預(yù)防和病害防治。本文以新鮮大口黑鱸為材料，5%乙酸為提取液從大口黑鱸不同組織中提取抗菌肽粗提物，并對其粗提物進行了抑菌活性檢測，為進一步研究大口黑鱸的非特異性免疫奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 菌種為嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)中國微生物保藏中心提供;大腸桿菌(Escherichia coli)吉林農(nóng)業(yè)大學藥理實驗室提供;鏈球菌(Streptococcus)吉林農(nóng)業(yè)大學藥理實驗室提供?？捡R斯亮藍G250;標準牛血清白蛋白，SephadexG－25凝膠過濾柱。

1.2 試驗動物及取材 選擇體況健康的活體大口黑鱸(購于水產(chǎn)市場)，將魚置于冰板上，將其表面撒少許氯化鈉，促進其粘液分泌迅速用刀片將體表的黏液刮下，放于10 mL離心管中，冰浴保存，備用。刮去皮膚表面的魚鱗，再剝離皮膚，用蒸餾水洗去血水，去掉膜組織、脂肪組織后冰浴保存，剖開腹腔，迅速采集肝臟、脾、卵、鰓等組織稱重，冰浴保存，備用。

1.3 方法

1.3.1 組織中抗菌物質(zhì)的提取 采用5%乙酸提取法［4］。皮膚組織先用剪刀剪碎，其他組織可用研缽研碎后，分裝到10 mL離心管中，進行組織搗碎3次，每次10 s，超聲細胞破碎10次，每次2 s，漩渦勻漿2 min，獲得勻漿液。加入二倍體積的5%乙酸，4℃攪拌2 h，浸提24 h，4℃條件下10000 r/min離心30 min，取上清液，殘渣中再次加入二倍體積的5%乙酸，4℃攪拌過夜，4℃條件下10000 r/min離心30 min，取上清液，合并兩次上清液，用 NaOH(0.5 mol/L)調(diào)整 pH 值為7.0，4 ℃條件下10000 r/min 離心30 min，收集上清液，過0.45 μm 濾膜除去雜質(zhì)，即為抗菌肽的粗提液，將粗提液注入透析袋(截留分子量3500 Da)，扎緊袋口，然后將其放入裝有聚乙二醇的托盤中，4℃條件下濃縮到體積接近10～20 mL，將溶液到出，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 粗提物蛋白質(zhì)含量測定 采用考馬斯亮藍G－250法測定蛋白含量。樣品中蛋白質(zhì)含量(μg/g)=CVt/WVs，其中C為通過準曲線計算的值μg;Vt為粗提液總體積mL;W為樣品鮮重g;Vs為測定時加樣體積mL。

1.3.3 粗提物抑菌試驗 采用平板法測定抑菌直徑并計算抑菌率。

無菌操作，將滅菌后的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15 mL注入平板凝固后，將滅菌的濾紙片(孔的直徑為6 mm)平鋪于培養(yǎng)基上。取20 μL粗提液滴加在培養(yǎng)基的濾紙片上，同時設(shè)生理鹽水20 μL的空白對照。再按照嗜水氣單胞桿菌30℃培養(yǎng)24 h，大腸桿菌37℃培養(yǎng)12 h，鏈球菌37℃培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈形成，測量抑菌圈直徑，直徑越大抑菌越強。判斷標準:菌活性強弱用抑菌圈直徑表示，抑菌環(huán)直徑等于抑菌圈外徑減濾紙直徑，抑菌環(huán)直徑≤10 mm為弱，11～15 mm為中，≥16 mm為強。選取具有抑菌活性的組織進行抑菌率測定。將適量的濃縮抗菌肽樣品取100 μL，加 LB培養(yǎng)基30 μL和菌液70 μL并混勻，于30℃、37℃搖床孕育培養(yǎng)1 h，取50 μL涂布于LB平板，進行培養(yǎng)，嗜水氣單胞菌、大腸桿菌，分別于30℃培養(yǎng)24 h，37℃培養(yǎng)12 h。計算菌落數(shù)，以蒸餾水為對照組。計算抑菌率。

1.3.4 肝臟粗提物分離及抑菌活性測定 將濃縮后的肝臟粗提液過0.45 μm濾膜，用于SephadexG－25(1.5 cm×30 cm)凝膠過濾層析分離。凝膠柱預(yù)處理后進行裝柱、平衡、上樣、洗脫。將粗提液10 mL上樣于SephadexG－25凝膠過濾柱，用蠕動泵控制流速為0.5 mL/min。用0.2 mol/L乙酸鈉溶液以流速0.5 mL/min洗脫，收集各峰洗脫液，每10 min收集1管。用酶標儀測各管洗脫液在280和260 nm的吸光度。計算其蛋白質(zhì)濃度并進行抑菌試驗，其中A280為280 nm處測得的吸光度值，A260為260 nm處測得的吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 大口黑鱸不同組織粗提物蛋白質(zhì)濃度及產(chǎn)率

由表1試驗結(jié)果可知大口黑鱸各個組織蛋白質(zhì)濃度分別為:粘液0.276、皮膚 0.718、肝臟 0.567、鰓 0.426、卵2.515、脾 0.351 mg/mL?？咕崛∥锂a(chǎn)率分別為粘液0.0023%、皮膚 0.03%、肝臟 0.263%、鰓0.041%、卵0.215%、脾0.171%。其中只有肝臟和卵的產(chǎn)率達到了0.2%以上，脾的產(chǎn)率達到0.17%。

表1 大口黑鱸不同組織粗提物蛋白質(zhì)濃度及產(chǎn)率

2.2 粗提物抑菌活性及抑菌率 由表2和表3可知粘液、皮膚、肝臟組織抗菌肽粗體物對嗜水氣單胞菌的抑菌有中等強度的抑菌活性，抑菌圈直徑分別為12.30、13.50 和12.10 cm。皮膚、肝臟抗菌肽粗提物對大腸桿菌具有較弱的抑菌活性，抑菌圈直徑分別為10.08和9.20 cm。各組織對鏈球菌均未見到抑菌圈。皮膚組織對嗜水氣單胞菌的抑菌率大于肝臟和粘液組織，皮膚組織對大腸桿菌的抑菌率大于肝臟組織。粘液、皮膚、肝臟組織抗菌肽粗體物對嗜水氣單胞菌的抑菌率分別為51.13%、59.14%和54.40%。皮膚、肝臟組織抗菌肽粗體物對大腸桿菌的抑菌率分別為50.25%和50.71%。

表2 各組織不同菌種抑菌圈直徑

表3 各組織不同菌種抑菌率

2.3 肝臟組織粗提物初步分離及抑菌活性 肝臟組織粗提物經(jīng)過凝膠過濾層析后，收集了36管洗脫液，進行抑菌試驗及蛋白質(zhì)濃度測定，試驗結(jié)果表明嗜水氣單胞菌具有抑菌活性的洗脫液出現(xiàn)在17、18、19、20 號管，其蛋白質(zhì)濃度分別為 0.392、0.434、0.425 和 0.417 mg/mL，且只有第 18 管抑菌活性為中，其他三管均顯示比較弱的抑菌活性(表4)。

表4 肝臟組織層析液蛋白濃度及抑菌活性

3 討論與結(jié)論

抗菌肽屬小分子堿性多肽，提取小分子多肽的方法主要有水浸提法、有機溶劑抽提法、有機酸抽提法等?？紤]到抗菌肽具陽離子特性，采用5%乙酸浸提，既可避免強酸、強堿對其的破壞，又可以獲得較高含量的抗菌肽粗提物。試驗采用5%乙酸法提取大口黑鱸不同組織中抗菌肽，提取液加入量為原材料的2倍體積，采用2次加入，分別提取，并采取24 h浸提攪拌的方式，加快蛋白質(zhì)溶出速度。試驗結(jié)果表明大口黑鱸各個組織蛋白質(zhì)濃度及產(chǎn)率均有不同，說明魚體各個組織蛋白質(zhì)含量存在著差異。

大量研究表明抗菌肽對水產(chǎn)常見病原菌具有抑菌作用［5－7］。Park 等［8］從泥鰍體上分離到一個21氨基酸的抗菌肽Misgurin，具有較強的體外廣譜抗菌活性。這與本試驗結(jié)果相似，試驗提取的大口黑鱸皮膚、肝臟組織中的粗提物對嗜水氣單胞菌和大腸桿菌均有抑菌作用。但是由于抗菌肽提取物的抑菌活性強弱受多種因素的影響，導(dǎo)致不同組織中抗菌活性肽的含量不同，抑菌作用也不同。皮膚、肝臟、粘液粗提物對嗜水氣單胞菌有抑菌作用，且皮膚組提取物抑菌作用最強，皮膚、肝臟組織粗提物對大腸桿菌有抑菌作用，且皮膚組織抑菌活性強于肝臟組織。說明皮膚作為魚類第二免疫防御組織在應(yīng)對外來微生物入侵時起到重要的作用，不同組織所含的抗菌物質(zhì)不僅量有差異，對同一細菌的抑制作用也存在差異。Fernandes等［9］從虹鱒皮膚中分離純化得到的oncorhyncinⅡ，分析表明它對革蘭陽性細菌(M.luteus和P.citreus)和革蘭陰性細菌(E.coli和 L.anguillanum)均有抑制作用。Destoumieux等［10］從養(yǎng)殖的南美白對蝦的血細胞和血漿中分離了幾種抗菌活性因子，其中3種具有抗真菌和抗細菌尤其是抗革蘭氏陽性菌的活力。王輝等［11］從健康牙鲆皮膚、鰓、肝臟、腎臟組織中提取得到了具有抗菌活性粗提物。各組織粗提物對大腸桿菌、鰻弧菌及魚類鰻弧菌有較強的抑菌活性。劉倩等［12］從鯽魚的肝、腎、鰓、皮膚粘液中提取出抗菌活性物質(zhì)，對大腸桿菌和鰻弧菌具有抑菌活性。并且其抑菌效果有組織特異性。李聯(lián)泰［13］從黃鱔皮膚黏液中分離純化出具有抗菌和鎮(zhèn)痛活性的多肽，對嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌有較強的抑菌效果。陳詔等［14］從布氏石斑魚頭腎提取出抗菌肽粗提物，試驗表明該粗提物不僅對金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌有良好抑制作用，而且對大腸桿菌、哈氏弧菌和溶藻弧菌等革蘭氏陰性菌也有良好抑制效果。蘇建明等［4］從草魚腸道組織提取出相對分子量約為6200的抗菌肽，抑菌試驗表明該抗菌肽對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和嗜水氣單胞菌均表現(xiàn)出較強的抗菌活性。陳成勛等［15］從革胡子鯰體表粘液中提取出抗菌肽粗提物，對遲緩愛德華氏菌、嗜水氣單胞菌和對大腸桿菌均有不同程度的抑菌作用。單曉楓等［16］采用甲醇提取、SephadexG－50凝膠層析等從其體表粘液中提取抗菌肽對嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌、鰻弧菌、溶藻弧菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等均有抑菌活性。以上研究結(jié)果表明抗菌肽存在于水產(chǎn)動物機體的多個組織，但同一組織中抗菌活性物質(zhì)對不同細菌的抑制效果不同，不同組織中抗菌活性物質(zhì)對細菌的抑菌作用也不相同，這也與本研究的結(jié)果相似。

肝臟組織粗提物通過Sephadex－G25凝膠柱過濾層析后，獲得了4個保留時間的具有抑菌活性的收集液，但抑菌活性減弱。這可能是分離純化的試驗條件及操作過程導(dǎo)致了蛋白的生物活性部分丟失或失活，進而影響了抗菌物質(zhì)的抑菌活性。因此，在以后的研究工作中應(yīng)加強對分離純化方法以及如何保存蛋白的生物活性方面的研究。

研究結(jié)果表明，大口黑鱸皮膚和肝臟組織提取物對嗜水氣單胞菌、大腸桿菌具有抑菌作用。

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