班付國，胡興娟，2，吳寧鵬* ，彭 麗，孟 蕾，周紅霞，毛建輝

(1.河南省獸藥監(jiān)察所，鄭州450008;2.鄭州大學(xué)，鄭州450008;3.河南省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測檢驗中心許昌分中心，河南許昌461000)

獸藥殘留的毒性作用大多是通過長期積累而造成的，比如林可胺類藥物殘留可引起腎功能障礙和革蘭氏陽性菌的耐藥性增加;四環(huán)素類藥物容易與骨骼中的鈣結(jié)合，從而抑制骨骼和牙齒的生長;大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留可引起過敏反應(yīng)和導(dǎo)致攜帶耐藥因子的菌株擴(kuò)散;氯霉素可引起貧血灰嬰綜合征、白血病等。因此，歐盟和我國制定了相關(guān)藥物的殘留標(biāo)志物以及在不同的動物性食品中的最大殘留限量，并規(guī)定了畜牧業(yè)禁止使用的獸藥種類。但是，目前濫用獸藥情況比較普遍，其用量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了動物治療疾病的需要量，因此，建立獸藥的殘留檢測方法勢在必行。

國內(nèi)外現(xiàn)有的多殘留檢測方法主要有LC-Q-TOF［1-3］和 LC-MS/MS［4］方法，存在檢測藥物的種類單一、前處理方法復(fù)雜、靈敏度低等缺點。我國在獸藥多殘留檢測的研究起步較晚，且目前同時定量測定多種獸藥的方法也較缺乏。本方法針對我國畜產(chǎn)品養(yǎng)殖過程中常用的獸藥，利用UPLC-MS/MS高效分離和定性、定量準(zhǔn)確的特點，對磺胺類、氟喹諾酮類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類和林可胺類等11類66種藥物建立了豬肉中UPLC-MS/MS檢測方法，為主管部門對市場上含有超標(biāo)獸藥及違禁獸藥的豬肉進(jìn)行有效監(jiān)管提供了技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器 Acquity UPLC-XEVO TQ-S液質(zhì)聯(lián)用儀，配電噴霧離子源(ESI)(美國Waters公司);METTLE TOLEDO XP205電子分析天平(感量0.01mg，梅特勒-托利多儀器公司);高速冷凍離心機(jī)(德國Sigma公司);R215 Professional旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士，Buchi);Organomation Associates氮吹儀(Jnc公司);超聲波清洗器(昆山);Agela Technologies Cleanert?PEP-2固相萃取柱(6 CC/500 mg)。

1.2 試劑 金剛烷胺、金剛乙胺、氟哌利多、氟哌啶醇、阿扎派隆、異丙嗪、地西泮標(biāo)準(zhǔn)品，含量均大于98%，購于百靈威公司;氯霉素、頭孢喹肟、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺喹惡啉、磺胺二甲嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺吡啶、磺胺二甲唑、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲異嘧啶、磺胺甲氧嗪、磺胺氯吡嗪、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺異噁唑、苯?；前?、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺噻唑、甲氧芐啶、金霉素、四環(huán)素、土霉素、阿奇霉素、羅紅霉素、吉他霉素、林可霉素、泰樂菌素、泰妙菌素、替米考星、克拉霉素、克林霉素、安替比林、阿托品由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供，含量大于98%;奧硝唑、地美硝唑、卡硝唑、替硝唑、甲硝唑、羅硝唑、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星、二氟沙星、那氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星、氟甲喹、惡喹酸、萘啶酸、西諾沙星、洛美沙星、氧氟沙星、依諾沙星購于Dr.Ehrenstorfer公司，含量大于98%;氨基比林購于中國藥品生物制品檢定所，含量大于98%;對乙酰氨基酚、氨苯砜購于中國食品藥品檢定研究院，含量大于98%;甲醇、乙腈為色譜純(Sigma公司);乙二胺四乙酸二鈉、氯化鈉為分析純;實驗用水為經(jīng)Milli-Q凈化系統(tǒng)制備的去離子水;PEP-2固相萃取柱(6 CC/500 mg，Agela Technologies)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中;對于難溶藥物，頭孢喹肟先加入適量二甲基亞砜使其溶解，再用甲醇定容，配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。-20℃下保存，有效期為三個月。準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，用甲醇稀釋成一定濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 樣品前處理 稱取豬肉2 g于50 mL離心管中，分別加入 200 μL 0.1 mol/L EDTA溶液和10 mL乙腈/甲醇(V/V，95∶5)提取液，渦旋混勻后，振蕩20 min。于離心機(jī)上5000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至25 mL雞心瓶中。向殘渣中加入10 mL乙腈/水(V/V，15∶2)溶液進(jìn)行重復(fù)提取，合并兩次提取液。雞心瓶中加入0.38 g NaCl后于40℃下旋蒸至溶液剩余約1 mL。分別用1 mL乙腈和15 mL水清洗雞心瓶，并將溶液轉(zhuǎn)移至潔凈50 mL離心管中，備用。PEP-2固相萃取柱依次用甲醇和水各5 mL活化，將備用液全部過柱。用2 mL水淋洗，抽干。用3 mL乙腈和3 mL甲醇分別洗脫，收集洗脫液，于40℃下氮氣吹干。準(zhǔn)確加入乙腈/水(V/V，20∶80)溶液1.0 mL溶解定容，渦旋混勻，過0.22 μm微孔濾膜，上液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.5 儀器分析方法 色譜柱為Waters UPLCTMBEH C18(100 mm ×1.0 mm，1.7 μm);流動相 A 為0.1%甲酸水溶液，流動相B為甲醇溶液，流動相C為水，流動相D為乙腈;其中正、負(fù)離子模式按表1梯度洗脫;流速0.1 mL/min;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量2 μL。

電噴霧離子源，多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)。電離電壓為2.9 kV;源溫為150℃，脫溶劑溫度為500℃;錐孔氣流速為150 L/h，脫溶劑氣流速為1000 L/h;定性離子對、定量離子對及對應(yīng)的碰撞能量參考值見表2。

表1 梯度洗脫程序

表2 藥物的定性、定量離子和錐孔電壓、碰撞能量

續(xù)表

續(xù)表

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系 稱取空白試樣，按照上述方法處理，在氮氣吹干前，準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，加入洗脫液中，根據(jù)各個藥物的定量限LOQ制得0.5LOQ、LOQ、2LOQ、5LOQ、10LOQ、20LOQ 濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，各藥物在相關(guān)濃度范圍內(nèi)呈良好線性相關(guān)(表3)，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。2LOD濃度空白豬肉添加試液中66種獸藥色譜圖見圖1。

2.2 檢測限和定量限 檢測限:添加一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于2 g空白豬肉中，經(jīng)過提取凈化并測定，藥物的信噪比S/N≥3時，即可得到藥物的檢測限，其結(jié)果見表3。

定量限:添加一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于2 g空白豬肉中，經(jīng)過提取凈化并測定，藥物的信噪比S/N≥10時，即可得到藥物的定量限，其結(jié)果見表3。

2.3 方法精密度與準(zhǔn)確度 在空白豬肉中分別添加LOQ、2LOQ、5LOQ三個濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度做5個平行，其平均回收率、變異系數(shù)如表3所示?？梢钥闯?，66種藥物的平均回收率在35%～140%之間，批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于20%。

3 討論與小結(jié)

3.1 液相條件優(yōu)化 對于多組分分析，采用梯度洗脫更易于藥物的分離。本方法以ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm ×1.0 mm，1.7 μm)作為色譜柱，考察了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-水和甲醇-0.1%甲酸水溶液四種流動相體系，經(jīng)過對比發(fā)現(xiàn)，正離子模式使用甲醇-0.1%甲酸水溶液，負(fù)離子模式使用乙腈-水時，能獲得較好的峰型及較高的響應(yīng)。

3.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化 實驗采用0.2 mg/L各個藥物的標(biāo)準(zhǔn)溶液在電噴霧離子源正負(fù)離子模式下，采用流動注射泵連續(xù)進(jìn)樣方式進(jìn)行全掃描，確定準(zhǔn)分子離子。以分子離子為母離子對子離子全掃描，在多反應(yīng)監(jiān)測模式下對其質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化。最后選取豐度較強(qiáng)的子離子作為定量離子，豐度次之的為定性離子?；前奉悺⒎Z酮類、林可胺類、四環(huán)素類、硝基咪唑類、大環(huán)內(nèi)酯類等藥物在［M+H］+模式下靈敏度較高，故選擇在正離子模式下進(jìn)行測定。氯霉素在［M-H］-模式下靈敏度較高，故選擇在負(fù)離子模式下進(jìn)行測定。

圖1 空白豬肉添加試液中66種獸藥色譜圖(2LOD濃度)

表3 豬肉中66藥物的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、平均回收率及RSD

續(xù)表

3.3 樣品前處理條件優(yōu)化 參考相關(guān)文獻(xiàn)［1-3］，提取多殘留藥物時一般使用甲醇、乙腈、TCA溶液或者乙腈、甲醇和一定比例水的溶液作為提取液。本實驗考察了乙腈、甲醇、乙腈/甲醇(95∶5，V/V)、乙腈/水(15∶2，V/V)和 5%TCA 溶液［5］等提取液，實驗結(jié)果表明:乙腈/甲醇(95∶5，V/V)和乙腈/水(15∶2，V/V)共同使用時，66種藥物的回收率相對較高，且無雜質(zhì)峰干擾。提取液中水和200 μL 0.1 mol/L EDTA溶液的存在能明顯提高四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類藥物的回收率［6-8］，這是因為EDTA能和組織中的重金屬離子絡(luò)合，從而避免這兩類藥物因絡(luò)合沉淀而造成回收率降低。

在測定多殘留藥物時，對提取液濃縮后直接進(jìn)樣，省去固相萃取柱凈化的步驟，從而縮短操作時間。但是基質(zhì)中的雜質(zhì)會堵塞色譜柱，干擾離子源信號。為更好的凈化上樣液，本實驗采用了Agela Technologies Cleanert?PEP-2固相萃取柱對提取液進(jìn)行濃縮凈化，該柱對各類極性、非極性化合物具有均衡的吸附作用，適用于多組分藥物的同時凈化。并對洗脫液和淋洗液進(jìn)行了考察，當(dāng)使用3 mL乙腈3 mL甲醇作為洗脫液，2 mL水作為淋洗液時各個藥物的回收率最優(yōu)，且具有較好峰形。

本文采用UPLC-MS/MS技術(shù)建立了豬肉中66種獸藥殘留的快速篩查分析方法。該方法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、篩查范圍廣，適合于豬肉中獸藥殘留的快速篩查分析，為畜產(chǎn)品進(jìn)行風(fēng)險監(jiān)測提供了一種有力的技術(shù)手段。

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