彭玉芬，蔡勤仁，薛良辰，吳潔珊，馮家望，凌蕓輝

(珠海出入境檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東珠海519015)

喹乙醇(olaquindox，OLA)，屬于喹噁啉類抗菌藥，本類藥物具有廣譜抗菌、促進(jìn)生長雙重作用。該類藥物曾經(jīng)被廣泛應(yīng)用于豬、牛、雞、羊和水生動(dòng)物促進(jìn)生長，抗菌治病，但近年來的研究表明，喹乙醇及其代謝物3-甲基-喹啉-2-羥酸(3-methylquinolin-2-carboxylic acid，MQCA)有中度至明顯的蓄積毒性，對(duì)大多數(shù)動(dòng)物有明顯的致畸作用，對(duì)人也有潛在的三致性，即致畸形、致突變、致癌。我國也出臺(tái)相應(yīng)的測定標(biāo)準(zhǔn)［1］。美國和歐盟都禁止將喹乙醇用作飼料添加劑?！吨腥A人民共和國獸藥典》(2005版)作出明確規(guī)定，喹乙醇禁止用于家禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖，但由于養(yǎng)殖者的違規(guī)使用，國內(nèi)水產(chǎn)品中仍屢有檢出喹乙醇?xì)埩?。目前，喹乙醇在豬［2-3］、雞［4-5］、兔［6］和老鼠［7］等陸生動(dòng)物體內(nèi)代謝的研究有見報(bào)道，但水生動(dòng)物的相關(guān)研究卻很少。本文建立了水產(chǎn)品中喹乙醇的LC-MS/MS檢測方法，并對(duì)喹乙醇在鯽魚體內(nèi)的消除規(guī)律進(jìn)行了研究，研究結(jié)果為水產(chǎn)品中喹乙醇的殘留檢測和不合格追溯提供了理論依據(jù)和技術(shù)手段，對(duì)保障我國食品安全具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 喹乙醇，含量為99.0%，CAS號(hào)為23696-28-8，Sigma公司生產(chǎn);3-甲基喹噁啉-2-羧酸，含量94.0%，CAS號(hào)為92513-28-5，Dr.Ehrenstorfer公司生產(chǎn);喹乙醇原料藥，購于廣州惠華動(dòng)物保健品有限公司;甲醇、乙腈、乙酸乙酯、鹽酸和甲酸均為色譜純(Merck)，其他試劑均為廣州化學(xué)試劑廠生產(chǎn)的分析純。

1.2 儀器和設(shè)備 WATERS UPLC高效液相色譜儀，API4000Q Trap質(zhì)譜儀(配有電噴霧離子源);HitachiCR22GII離心機(jī);Zymark TurboVap?LV濃縮儀;Siemens冰箱;恒溫水浴振蕩器等實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備。

1.3 試驗(yàn)魚及飼養(yǎng)條件 實(shí)驗(yàn)用鯽魚80尾，購自珠海一源水產(chǎn)品養(yǎng)殖場，體重(250±20)g，抽樣檢查無喹乙醇?xì)埩簦B(yǎng)在8個(gè)玻璃缸內(nèi)10 d后用于實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)期間不斷充氣并對(duì)水體進(jìn)行循環(huán)過濾，水溫控制在20～25℃，實(shí)驗(yàn)期間每日早晚投喂適量鯽魚飼料各1次，及時(shí)排出殘餌和糞便，每2 d換水1/2體積，實(shí)驗(yàn)期間鯽魚成活率為100%。

1.4 給藥與采樣 采用口灌給藥的方式，按劑量為50 mg/kg 給藥，從給藥后開始，第 0、1、2、3、4、5、7、9、12、15、20天用沙網(wǎng)撈起，隨機(jī)取鯽魚5尾，從每尾靜脈取血5 mL，放入離心管(離心管事先放入4滴1%的肝素鈉)，混合均勻后離心分離血漿，剖殺，迅速取出肝胰臟及背脊兩側(cè)肌肉，分別裝于白色塑料袋中，立即做好標(biāo)記，保存于-20℃冰箱中。

1.5 樣品前處理方法

1.5.1 喹乙醇提取 組織樣品:準(zhǔn)確稱取均質(zhì)后的試樣5 g，精確到0.01 g，置于50 mL聚丙烯離心管中，加入5 g中性氧化鋁，用20 mL乙酸乙酯+乙腈(1∶1，V/V)混合溶劑，振蕩 15 min，5000 r/min離心5 min，取上清液，樣品重復(fù)提取一次，合并提取液，加入10 mL正己烷，振蕩2 min，5000 r/min離心5 min，棄上層正己烷。45℃吹氮濃縮至近干，用1 mL流動(dòng)相溶解殘?jiān)?，旋渦混勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，用于LC-MS/MS測定。

血漿:取0.5 mL血漿于玻璃試管中，加入3%的三氯乙酸3.5 mL，渦旋30 s，渦旋混勻30 s，80℃水浴 5 min，3000 r/min 離心5 min，0.22 μm 微孔濾膜過濾，用于LC-MS/MS測定。

1.5.2 代謝產(chǎn)物MQCA的提取 準(zhǔn)確稱取2 g試樣，精確到0.01 g，置于50 mL離心管中，加入15 mL乙酸乙酯，旋渦混勻，振蕩15 min，4000 r/min離心5 min，取上清液轉(zhuǎn)入另一支50 mL離心管中，再用15 mL乙酸乙酯提取一次，合并上清液于同一離心管中。

往樣品殘?jiān)屑尤?.1 mol/L磷酸鹽緩沖液10 mL，旋渦混勻，振蕩15 min，8000 r/min 離心10 min，取上清液合并到離心管中，振蕩15 min，6000 r/min離心5 min，取下層溶液至50 mL具塞離心管中。

加入鹽酸 200 μL，混勻，再加入乙酸乙酯8 mL，振蕩 15 min，8000 r/min 離心 10 min，上層溶液轉(zhuǎn)入玻璃試管中，再用8 mL乙酸乙酯重復(fù)提取一次，合并上層溶液于同一玻璃試管，55℃吹氮濃縮至干，用1 mL 0.1%甲酸-甲醇(體積比95∶5)溶液溶解殘?jiān)?，旋渦混勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，用于LC-MS/MS分析。

1.6 測定

1.6.1 色譜條件 色譜柱:UPLC ACQUITY BEH C18 2.1×100 mm，1.7 μm;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:10 μL;流動(dòng)相A為5 mmol/L乙酸銨(含0.1%的甲酸)，B為乙腈。梯度洗脫(表1)。

表1 梯度洗脫程序

1.6.2 質(zhì)譜條件 離子源:電噴霧離子源(ESI);掃描方式:正離子掃描;檢測方式:多反應(yīng)選擇離子檢測;電噴霧電壓:5500 V;霧化氣:60 MPa，氣簾氣:20 MPa，輔助加熱氣:70 MPa;碰撞氣:Medium，四種氣體均為氮?dú)?離子源溫度:550℃;碰撞能量、去簇電壓見表2。

表2 喹乙醇及3-甲基喹噁啉-2-羧酸部分儀器參數(shù)

1.6.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 將喹乙醇及3-甲基喹噁啉-2-羧酸標(biāo)準(zhǔn)工作液依次稀釋得到0.001、0.005、0.010、0.050、0.100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)系列，由低到高的濃度進(jìn)行測定，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.4 回收率及精密度 在空白血漿、肌肉及肝胰臟中添加喹乙醇及3-甲基喹噁啉-2-羧酸濃度0.005 μg/mL(μg/g)、0.010 μg/mL(μg/g)和0.050 μg/mL(μg/g)，每個(gè)濃度 6 個(gè)重復(fù)，按 1.5項(xiàng)處理方法進(jìn)行處理后上機(jī)測試。

1.7 樣品中喹乙醇及其代謝物的測定 給藥后采集的血漿樣品及組織樣品的前處理按1.5項(xiàng)的操作方法進(jìn)行，然后上機(jī)測試，將測得的峰面積值代入相應(yīng)的回歸方程計(jì)算出樣品的濃度。

2 結(jié)果

2.1 喹乙醇及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定 在建立的色譜質(zhì)譜條件下，喹乙醇在0.001～0.100 μg/mL濃度范圍內(nèi)，峰面積(y)與濃度(x)呈良好線性關(guān)系，回歸方程分別為 y＝8330x+4970(r＝0.9996)。3-甲基喹噁啉 -2-羧酸在0.001～0.100 μg/mL濃度范圍內(nèi)，峰面積(y)與濃度(x)呈良好線性關(guān)系，回歸方程分別為y＝2490x-1410(r＝0.9999)，喹乙醇及3-甲基喹噁啉-2-羧酸的最低檢測限為0.001 μg/mL(μg/g)。

2.2 回收率及精密度的測定 喹乙醇的添加回收率(%)和變異系數(shù)(%)分別在60% ～86%、4.2% ～11.8%之間，3-甲基喹噁啉-2-羧酸的添加回收率(%)和變異系數(shù)(%)分別在60% ～92%、2.6% ～10.2%之間。

2.3 喹乙醇在各組織中的殘留消除 鯽魚按劑量為50 mg/kg口灌喹乙醇，不同組織的不同時(shí)間點(diǎn)的肌肉、血漿和肝胰臟中的喹乙醇濃度的實(shí)測值見表3，從表中可以看出喹乙醇在鯽魚體內(nèi)的消除非常迅速，血漿第五天檢測不到，組織中喹乙醇的濃度第七天小于0.001 μg/g。鯽魚口灌喹乙醇后肌肉中譜圖見圖1，從譜圖中可以看出喹乙醇與雜質(zhì)分離良好且檢測效率高。

2.4 代謝物在各組織中的殘留消除規(guī)律 鯽魚按劑量為50 mg/kg口灌喹乙醇后，不同時(shí)間點(diǎn)的肌肉、血漿和肝胰臟中的3-甲基喹噁啉-2-羧酸濃度的實(shí)測值見表4，從表中可以看出喹乙醇代謝物3-甲基喹噁啉-2-羧酸在鯽魚體內(nèi)消除比喹乙醇緩慢，而且在第五天時(shí)組織中3-甲基喹噁啉-2-羧酸的濃度有緩慢回升。肌肉中喹乙醇代謝物3-甲基喹噁啉-2-羧酸沒有雜質(zhì)干擾且峰形良好，具體見圖2。

表3 鯽魚口灌單劑量喹乙醇(50 mg/kg)后組織藥物濃度(μg/g) (n＝5)

表4 鯽魚口灌單劑量喹乙醇(50 mg/kg)后組織中代謝物3-甲基喹噁啉-2-羧酸藥物濃度(ng/g)(n＝5)

圖1 鯽魚口灌喹乙醇后肌肉MRM色譜圖

圖2 鯽魚口灌喹乙醇后肌肉中3-甲基喹噁啉-2-羧酸MRM色譜圖

3 討論

喹乙醇在動(dòng)物體內(nèi)吸收良好且迅速，適用于防治淡水養(yǎng)殖魚類細(xì)菌出血性敗血癥、癤瘡病等疾?。?］。在動(dòng)物體內(nèi)代謝過程中大部分以原形物質(zhì)的形式從體內(nèi)排出，其余主要以代謝物的形式經(jīng)腎臟排出。本實(shí)驗(yàn)不僅測定了血漿、組織中喹乙醇的含量，還對(duì)組織中喹乙醇代謝物進(jìn)行了研究，揭示了喹乙醇在鯽魚體內(nèi)的消除規(guī)律。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鯽魚按50 mg/kg口灌喹乙醇后，鯽魚血漿中喹乙醇的濃度1 d后為(6.56±0.49)mg/L，2 d后迅速下降到(0.18±0.04)mg/L，4 d 后喹乙醇下降至(0.0039±0.0008)mg/L，5 d后已經(jīng)檢測不到。肌肉中喹乙醇消除的規(guī)律與在血漿中相似，但消除的速度并不快，至3 d肌肉中喹乙醇的濃度還有(4.20±0.87)mg/kg，在第7天時(shí)完全檢測不到喹乙醇。肝胰臟中喹乙醇的消除與肌肉相比，消除速率更加快速。與艾曉輝等［9］通過口灌給藥方式一次性給予鯉魚30 mg/kg的喹乙醇后消除特征基本一致。喹乙醇在鯽魚體內(nèi)消除速度比雞［4-5］、兔［6］、鼠［7］慢。

喹乙醇代謝物3-甲基喹噁啉-2-羧酸在鯽魚肌肉和肝胰臟中消除比較緩慢，肌肉中到15 d基本檢測不到，肝胰臟中到20 d才檢測不到。但有一個(gè)共同點(diǎn)，在第5天的時(shí)候3-甲基喹噁啉-2-羧酸濃度有不同程度的回升，然后再下降直到檢測不出。通常情況下，應(yīng)該是達(dá)到最大藥物濃度后隨著時(shí)間的延長，組織中濃度越來越低，但由于魚是變溫動(dòng)物，出現(xiàn)藥物濃度下降后又回升這種情況可能與水溫的變化及魚體中某些臟器對(duì)藥物存在再吸收等因素的影響有關(guān)。這種現(xiàn)象在艾曉輝等［9］測定喹乙醇在鯉魚組織中的(第12小時(shí))濃度時(shí)出現(xiàn)過。

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