范建華，何友義，韋玉勇，徐 步*，卜仕金

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽所，江蘇揚(yáng)州225125;2.江蘇威泰龍生物科技有限公司，江蘇泰州225000;3.揚(yáng)州大學(xué)，江蘇揚(yáng)州225009)

替米考星是一種半合成大環(huán)內(nèi)酯類畜禽專用抗生素，常用于預(yù)防和治療雞毒支原體感染引起的支氣管炎、氣囊炎等［1］，是治療雞毒支原體感染等雞慢性呼吸道疾病的最有效藥物之一，至今尚未見有耐藥菌株的報(bào)道［2］。磷酸替米考星是替米考星磷酸鹽，易溶于水。為進(jìn)一步驗(yàn)證磷酸替米考星對(duì)雞毒支原體感染的防治效果，特進(jìn)行如下試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品 受試藥:磷酸替米考星可溶性粉:規(guī)格10%(以替米考星計(jì))，由湖北某獸藥廠提供。對(duì)照藥:替米考星可溶性粉，含量10%，由天津某獸藥廠生產(chǎn)。適應(yīng)癥為雞支原體等慢性呼吸道疾病治療，推薦用法與用量為:混飲，每1 L飲水加本品0.75 g(以替米考星計(jì))，連用3 d。

1.1.2 雞毒支原體菌種和抗原 雞毒支原體(MGS6)及MG培養(yǎng)基均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所饋贈(zèng);雞毒支原體血清平板凝集抗原由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽所生物安全研究室提供。

1.1.3 主要試劑及培養(yǎng)基 水解蛋白為美國(guó)Difco公司產(chǎn)品;酵母浸出物為英國(guó)OXOID公司產(chǎn)品;氨水25%(AR級(jí))，上海生工生物制劑有限公司生產(chǎn)。

1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物 200只1日齡蘇禽黃羽肉雞和小雞粉料均購自揚(yáng)州翔龍禽業(yè)發(fā)展有限公司，其中飼料為不加任何抗菌藥的小雞全價(jià)料。該雞群試驗(yàn)前血清學(xué)檢測(cè)雞毒支原體結(jié)果為陰性。受試雞采用網(wǎng)上飼養(yǎng)，自由采食和飲水，每天清理雞糞，雞舍自然通風(fēng)。

1.2 方法

1.2.1 雞毒支原體S6株菌液的制備 將冷凍保存的MGS6菌液解凍后取1mL接種于5 mL FM-4液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)3～4 d至顏色變黃，隨后置于-20℃冷凍保存。攻毒前先行在實(shí)驗(yàn)室通過非免疫雞接種復(fù)壯。菌種復(fù)壯經(jīng)傳代后測(cè)定菌液的顏色變化單位(ccu/mL)。

1.2.2 分組與給藥 蘇禽黃羽肉雛雞飼喂至14日齡后，從中挑選180只體重均勻、健康雞作為試驗(yàn)對(duì)象，隨機(jī)分成6組，每組30只，單羽稱量初始重，具體分組情況見表1。

表1 試驗(yàn)雞分組處理

1.2.3 人工疾病模型的復(fù)制 雞毒支原體人工發(fā)病模型參照邵國(guó)青等［3］報(bào)道的方法。試驗(yàn)雞于14日齡時(shí)各治療組及感染對(duì)照組每只雞經(jīng)左右氣囊注射接種雞毒支原體液體培養(yǎng)物(108～109ccu/mL)，劑量為0.2 mL/100 g體重。健康對(duì)照組注射無菌生理鹽水。接種后的試驗(yàn)雞于80 mg/L氨環(huán)境進(jìn)行應(yīng)激。

1.2.4 藥物治療 各治療組雞在接種支原體第5 d后(即個(gè)別雞出現(xiàn)呼吸癥狀時(shí))，受試藥各劑量組和藥物對(duì)照組分別按表1處理方法通過飲水給予相應(yīng)的藥物治療，連用3 d。健康及感染對(duì)照組不給藥，自由飲水。各組試驗(yàn)期間均自由采食。

1.3 療效評(píng)價(jià)指標(biāo)［4-5］

1.3.1 臨床觀察 用藥期間每天觀察各組雞的臨床癥狀，記錄死亡情況。對(duì)病死雞進(jìn)行剖檢并作病原學(xué)分離、確診。停藥后繼續(xù)觀察14 d。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)各實(shí)驗(yàn)組雞單羽稱末重、記錄每組飼料消耗量，并據(jù)此分別計(jì)算各組雞平均增重。分別根據(jù)下面公式計(jì)算相對(duì)增重率和飼料利用率。

相對(duì)增重率＝(試驗(yàn)組相對(duì)增重/健康對(duì)照組相對(duì)增重)×100%

飼料利用率(料肉比)＝平均飼料消耗總量(g)/平均增重(g)

1.3.2 死亡率 凡在試驗(yàn)期間，雞出現(xiàn)典型支原體感染癥狀并死亡的，并通過剖檢氣囊、肺等臟器發(fā)現(xiàn)有典型病變，且雞毒支原體分離陽性者，判定為雞毒支原體感染死亡。根據(jù)死亡雞數(shù)計(jì)算死亡率。

1.3.3 氣囊病變損傷計(jì)分 試驗(yàn)結(jié)束后各組隨機(jī)抽10只雞進(jìn)行剖檢，觀察氣囊、肺、肝、心等主要臟器器官變化，并對(duì)氣囊損傷程度進(jìn)行分級(jí)評(píng)分［1，3］。0級(jí):氣囊膜清潔、薄而透明，記0分;1級(jí):氣囊膜輕度渾濁，記2分;2級(jí):氣囊部分區(qū)域有灰白色滲出物，氣囊膜中度增厚，記4分;3級(jí):大部分氣囊布滿黃白色干酪樣滲出物，記6分;4級(jí):嚴(yán)重的氣囊炎，整個(gè)氣囊布滿黃白色干酪樣滲出物，氣囊增厚，記8分。并根據(jù)氣囊損傷記分結(jié)果計(jì)算氣囊損傷減少百分率。

1.4 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 用生物統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)的顯著性檢驗(yàn)，其中死亡率、氣囊損傷減少率用卡方檢驗(yàn)，增重采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工疾病模型 人工接種毒后第5天時(shí)，除健康對(duì)照組外，各組別均有少數(shù)雞出現(xiàn)精神不振，食欲減退;給藥后第2天，各用藥組癥狀均不同程度有所緩解，但在感染對(duì)照組中雞的呼吸道癥狀在加劇，少數(shù)雞出現(xiàn)持續(xù)性啰音，呼吸困難。感染對(duì)照組至種毒后第7天時(shí)2只雞死亡，剖檢發(fā)現(xiàn)呼吸道有較多粘液分泌、氣囊膜增厚、渾濁，內(nèi)有大量黃白色干酪樣滲出物;肺部有出血點(diǎn)，且伴有較嚴(yán)重的心包炎、心包腔積液等病理變化。在對(duì)病死雞氣囊分泌物病原學(xué)檢測(cè)時(shí)，可分離出支原體，其生物學(xué)特性與MGS6菌株吻合［4］，另外肝臟、肺組織中還分離出了大腸桿菌。這表明雞死亡原因可能因支原體感染加重后導(dǎo)致抵抗力下降進(jìn)而并發(fā)大腸桿菌感染所致。以上結(jié)果充分說明此次人工造病成功。

2.2 藥物治療效果 本次試驗(yàn)選擇死亡率、氣囊病變計(jì)分，以及相對(duì)增重率等作為主要試驗(yàn)監(jiān)測(cè)指標(biāo)。從表2結(jié)果來看，所有藥物試驗(yàn)組和藥品對(duì)照組在試驗(yàn)期內(nèi)，均未出現(xiàn)死亡，但各試驗(yàn)組前期卻表現(xiàn)出不同程度的呼吸道癥狀，而感染對(duì)照組在試驗(yàn)第7天，死亡2只，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步病原分離鑒定得出，屬支原體感染后期繼發(fā)感染大腸桿菌引起的死亡。表2結(jié)果同時(shí)顯示，試驗(yàn)期內(nèi)盡管受試藥各劑量組和藥品對(duì)照組的雞均增重及料肉比情況均好于感染組，但相對(duì)增重率統(tǒng)計(jì)結(jié)果差異不顯著(P＞0.05)。氣囊病變、損傷是支原體感染的典型表觀。本次試驗(yàn)經(jīng)抽選各組10只雞剖檢，感染對(duì)照組多數(shù)雞除氣囊明顯出現(xiàn)渾濁和干酪樣滲出外，還伴有嚴(yán)重的“包心”和“包肝”，與受試各藥物組比較，氣囊損傷減少率差異顯著(P＜0.05)，具體試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表2 藥物治療后對(duì)雞體增重影響

表3 藥物治療后對(duì)氣囊損傷的影響

3 討論與小結(jié)

單純感染MG的雞，一般僅出現(xiàn)輕微的呼吸道癥狀或隱性感染［2，7］。本次試驗(yàn)經(jīng)經(jīng)氣囊種毒，成功建立了人工感染雞毒支原體的造病模型，為進(jìn)一步開展受試藥物的療效試驗(yàn)奠定了良好基礎(chǔ)。受試藥高(1 g/L)、中(0.75 g/L)劑量組和藥品對(duì)照組均能有效控制雞毒支原體引起的雞呼吸道感染，減輕氣囊損傷，同時(shí)可減輕因感染雞毒支原體引起的增重下降，這與國(guó)內(nèi)宗昕如［8］、高迎春［6］等的報(bào)道基本一致。因此，推薦磷酸替米考星可溶性粉用于治療支原體感染引起的雞慢性呼吸道疾病的最佳治療方法為:劑量0.75 g/L，連續(xù)飲水給藥3 d。

［1］Frey M L，Hanson R P＆Anderson D P.A medium for the isolation of avian mycoplasmas［J］.Am Vet Res，1968，29:2163-2171.

［2］Lam K M.Resistance of chickens immunized against M.gallisepticum is mediated by bursal dependent lymphoid cells［J］.Vet Microbiology，1984，9:509-514.

［3］邵國(guó)青，許偉成，薛家賓，等.雞毒支原體人工發(fā)病封閉模型的建立［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1998，14(4):228-231.

［4］中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第1247號(hào).抗菌藥物Ⅱ、Ⅲ期臨床藥效評(píng)價(jià)試驗(yàn)指導(dǎo)原則［Z］.

［5］徐叔云，卞如濂，陳修，等.藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.第三版.人民衛(wèi)生出版社:1647-1651.

［6］高迎春，張傳津，陸慶泉，等.替米考星溶液對(duì)肉仔雞人工感染雞敗血霉形體所致慢性呼吸道病的療效試驗(yàn)［J］.家禽科學(xué)，2004，20(5):10-13.

［7］劉軼秋，趙 暉，徐 磊，等.替米考星及其他抗菌藥對(duì)雞毒支原體的體外聯(lián)合抑菌試驗(yàn)［J］.中國(guó)家禽，2012，24(20):30-32

［8］宗昕如，張曉輝，辛凌翔，等.磷酸替米考星可溶性粉對(duì)人工感染雞支原體的治療試驗(yàn)［J］.畜牧與獸醫(yī)，2013，12(8):23-24.