李偉杰，蔣桃珍，魏財文，豈曉鑫，田 野

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

微生物保藏就是對活體微生物群體進行有效的保藏，微生物保藏的基本目的是保持其純度、活性并盡可能減少變異，最終目的是為科技創(chuàng)新和生物經(jīng)濟發(fā)展提供有效的支撐。目前用于微生物的保藏技術可以分為四類:傳代法、干燥法、冷凍法和冷凍干燥法［1］，其原理主要是運用干燥、低溫和隔絕空氣的手段，抑制微生物的新陳代謝，使其生命活動處于半永久性休眠狀態(tài)，從而達到保藏的目的?，F(xiàn)在簡易的保藏方法，例如定期移植法、液體石蠟法，在很多實驗室和保藏機構還在使用，而砂土保藏法、硅膠干燥法等簡易的保藏方法，已經(jīng)很少見到。當今公認的最安全、最可靠的長期保存微生物的方法是冷凍法和冷凍干燥法，它們適用于大多數(shù)微生物的保藏。

冷凍干燥保藏技術適用范圍廣泛，除少數(shù)不產(chǎn)生孢子只產(chǎn)生菌絲體的絲狀真菌不宜采用外，其它微生物如細菌、病毒等均可采用此方法。其基本原理是微生物和凍干保護劑在低溫下先行凍結至共晶點以下，然后在適當?shù)恼婵窄h(huán)境下進行冰晶升華干燥，隨后進行解吸干燥，除去部分結合水，從而獲得干燥的微生物產(chǎn)品，最后進行真空熔封，在低溫、避光環(huán)境下保藏［2］。

1 影響冷凍干燥保藏的因素

1.1 菌齡和細胞濃度 凍干微生物的菌齡對其冷凍干燥保藏后細胞存活率有重要影響，例如鼠李糖乳桿菌在生長的穩(wěn)定期進行冷凍干燥，細胞存活率為31% ～50%，而在生長對數(shù)期為14%，在生長遲緩期僅為2%［3］。研究表明:生長時期不同，細胞的生理狀態(tài)差異很大，對外界環(huán)境條件的反應程度不一。處于穩(wěn)定期的細胞或成熟的孢子對不良環(huán)境具有較強的抗性，因而，保藏不產(chǎn)芽孢細菌、酵母菌，應采用對數(shù)末期或穩(wěn)定期初期的細胞;而保藏產(chǎn)芽孢細菌、放線菌和霉菌，要用成熟的孢子，相應的時期為產(chǎn)芽孢細菌在細胞的分化階段、放線菌在生長II期，霉菌在無性孢子繁殖期和有性孢子繁殖期。在冷凍干燥保藏技術中，為保證在使用時有足夠數(shù)量存活的細胞，凍干前通常要加大細胞密度，細菌和放線菌濃度一般在108～109CFU/mL，酵母菌和霉菌孢子的濃度一般要大于107CFU/mL。

1.2 凍干保護劑 凍干保護劑可分為小分子保護劑(如低聚糖類、醇類和緩沖鹽類)和大分子保護劑(如蛋白質、多肽類和多糖類)。小分子保護劑，一般具有很強的親水性，分子結構中含有氫鍵，在冷凍或干燥過程中，可與菌體細胞膜磷脂中的磷酸基團或菌體蛋白質極性基團形成氫鍵，保護細胞膜和蛋白質結構與功能的完整性。而大分子保護劑通過“包裹”形式保護菌體，同時，促進低分子保護劑發(fā)揮作用［4］。保護劑類型的選擇主要取決于菌株的生物學特性，脫脂牛乳、血清、蔗糖等既是有效的凍干保護劑又是很好的低溫保護劑。研究表明利用海藻糖作為凍干保護劑可以提高微生物的存活率［5］，其中一個重要原因是海藻糖的玻璃化溫度較高，而玻璃化溫度越高，凍干樣品在溫度升高時更容易保持穩(wěn)定。由于蛋白的玻璃化溫度相對更高，因此在微生物保藏中經(jīng)常把蛋白和糖的混合物作為凍干保護劑。Abadias等［6］試驗表明 Candida sake利用脫脂牛乳和碳水化合物作保護劑，菌株細胞存活率可達85.9%。

1.3 冷凍干燥工藝

1.3.1 預凍 預凍過程一方面要保護微生物的主要性能不變，另一方面要獲得凍結后微生物有合理的結構，以利于水分的升華。預凍效果主要由3個方面決定:預凍速率、預凍最低溫度、預凍時間。(1)預凍速率是影響微生物存活率的重要因素，由于微生物細胞對水分的滲透率不同，導致不同微生物最佳預凍速率不同?？焖賰鼋Y，胞內的水分來不及通過細胞膜滲出，胞內溶液過冷而結冰，細胞的體積膨大，最后導致細胞破裂;慢速凍結，胞外溶液中水分大量結冰，溶液的濃度提高，胞內的水分便大量向外滲透，導致細胞的劇烈收縮，造成細胞損傷［7］。實驗證明，快速凍結導致升華速率低，解吸速率快，慢速凍結反之。實際上一般凍干微生物樣品的預凍速率介于快凍與慢凍之間。就細菌而言，通常采用分段降溫速率，從室溫快速降到約4℃，然后每分鐘降低1℃至－40℃，最后按每分鐘3～5℃的速率降至－70℃左右［7］。(2)預凍最低溫度一般應低于溶液共晶點溫度，即在共晶點溫度以下8～10℃。共晶點與微生物類群、保護劑的種類和濃度有關。(3)適宜的預凍時間是指一次干燥之前所有的微生物樣品均已凍實所需要的時間，以免因抽真空而引起噴瓶。若預凍時微生物樣品凍結不實，凍干后微生物樣品表面凹凸不平。一般要求凍干瓶裝厚度不超過10 mm。微生物樣品的固體含量一般為2% ～10%，如低于2%，凍干微生物樣品結構的機械性能就可能不穩(wěn)定，而高于10%則凍干不易成功，且復水也比較困難［8］。

1.3.2 一次干燥(升華干燥) 一次干燥主要是使微生物樣品中凍結的自由水升華逸出。升華干燥的時間與微生物樣品的種類、分裝的厚度及升華時提供的熱量有關。凍干期間水升華的驅動力為微生物樣品與冷阱之間的溫差。通常升華干燥階段冷阱溫度為－60℃(至少比微生物樣品溫度低20℃)。解吸干燥階段冷阱溫度要求低至－80℃，這樣獲得的凍干品殘留水量較少。為達到較快的干燥速度，微生物樣品溫度要求盡可能高，但必須低于共晶點溫度或崩解溫度，以防止微生物樣品熔化或崩解，出現(xiàn)干縮和鼓泡現(xiàn)象，造成微生物凍干樣品溶解性差［9］。在凍干時主要靠傳導方式提供熱量，凍干品的熱量主要從擱板獲得，擱板與微生物樣品之間有效的熱傳遞與界面溫度所對應的飽和蒸汽壓和干燥室內真空度之差有關。升華階段的真空度在10～30 Pa時，較有利于熱量的傳遞和升華的進行。若壓強過低，則對傳熱不利，微生物樣品不易獲得熱量，升華速率反而降低，對設備的要求也更高;而當壓強過高時，微生物樣品內冰的升華速度減慢，微生物樣品自身溫度會上升，當高于共晶點溫度時微生物樣品將發(fā)生熔化而導致凍干失敗。干燥室壁溫、底盤側邊高度、安瓿瓶的排列方式均會影響傳熱效果，并將影響升華速率［10］。

1.3.3 二次干燥(解吸干燥) 二次干燥主要是去除部分結合水。這部分水主要靠范德華力和氫鍵吸附在微生物樣品上，需要更多的能量才能將其除去。升華干燥后微生物樣品殘留水分通常在10%左右，解吸干燥后殘余水分一般應低于2%。凍干微生物樣品中的殘留水分對凍干微生物質量影響很大，殘留水分過多，微生物容易失活，穩(wěn)定性變差。為控制凍干微生物樣品中的殘留水分，解吸干燥時應在保持微生物樣品活性的條件下選擇允許的最高溫度，真空度需盡可能提高，一般這一過程需4～6 h。自動化較高的凍干機可通過壓力升高試驗以獲得對殘留水分進行控制的相應數(shù)據(jù)。微生物冷凍干燥一般工藝曲線見圖1［11］，在實際應用中要根據(jù)不同微生物種類和選用的凍干保護劑做適當?shù)膬?yōu)化和調整。

圖1 冷凍干燥一般工藝曲線

2 凍干微生物樣品的常見問題及解決措施

2.1 噴瓶現(xiàn)象 噴瓶現(xiàn)象是由于微生物樣品在預凍時，沒有完全凍實就抽真空的緣故。解決方法是適當延長預凍時間。

2.2 干縮現(xiàn)象 干縮現(xiàn)象是由于微生物樣品在升華干燥過程中，溫度超過了共晶點或崩解溫度，出現(xiàn)局部熔化，由液體蒸發(fā)為氣體，造成體積縮小，或者干燥產(chǎn)品溶入液體之中，造成體積縮小。解決方法是降低加熱溫度和提高凍干箱的真空度。

2.3 剩余水分不合格現(xiàn)象 剩余水分不合格是由于解吸干燥的時間不夠，或微生物樣品達到允許的最高溫度后未恢復高真空。解決方法是延長解吸干燥的時間，并在產(chǎn)品達到允許的最高溫度后恢復高真空。

2.4 溶解性差的問題 產(chǎn)品干燥過程中發(fā)生局部濃縮，例如產(chǎn)品內部有夾心的硬塊，它是在升華中發(fā)生熔化，產(chǎn)生蒸發(fā)干燥濃縮造成的。解決方法是適當降低板層溫度，提高凍干箱的真空度或延長升華干燥的時間［9］。

3 結語

微生物冷凍干燥保藏技術涉及生物學、機械、制冷、真空和自動化控制等多門學科，影響因素眾多，包括菌齡、細胞濃度、凍干保護劑、冷凍干燥工藝、安瓿瓶的規(guī)格等。隨著微生物冷凍干燥保藏技術與設備的日益完善，以及對影響微生物冷凍干燥保藏各種影響因素的深入研究，可以使我們不斷提高微生物保存的質量，延長其保存期限，進而對其質量加以控制。

［1］李 雁，鄭從義.微生物物種多樣性的保護與其資源保藏［J］.氨基酸和生物資源，2003，25(3):4－6.

［2］霍 貞.冷凍干燥的工藝流程及其應用［J］.干燥技術與設備，2007，5(5):261 －264.

［3］Corcoran B M，Ross R P，F(xiàn)itzgerald G F，et al.Comparative survival of probiotic lactobacilli spray－dried in the presence of prebiotic substances［J］.Journal of Applied Microbiology，2004，96(5):1024－1039.

［4］Palmfeldt J，Radstrom P，Hahn－Hagerdal B.Optimisation of initial cell concentration enhances freeze－drying tolerance of Pseudomonas chlororaphis［J］.Cryobiology，2003，47(1):21 －29.

［5］楊曉菲，王 棟.副豬嗜血桿菌凍干保護劑的研究［J］.中國獸藥雜志，2013，47(8):18－21.

［6］Abadias M，Teixido N，Usall J，et al.Viability，efficacy，and storage stability of freeze－dried biocontrol agent Candida sake usingdifferent protective and rehydration media［J］.Journal of Food Protection，2001，64(6):856－861.

［7］陶天申，楊瑞馥，冬秀珠.原核生物系統(tǒng)學［M］.北京:化學工業(yè)出版社，2007:73－75.

［8］劉洪斌，吳 強，鄭桂軍.獸醫(yī)生物制品冷凍真空干燥技術研究進展［J］.畜牧獸醫(yī)科技信息，2004，(10):12－14.

［9］林澤培.耐熱保護劑活疫苗凍干技術［J］.中國獸藥雜志，2009，43(3):58－60.

［10］Gan K H，Bruttini R，Crosser O K，et al.Freeze－drying of pharmaceuticals in vials on trays:effects of drying chamber wall temperature and tray side on lyophilization performance［J］.Int J Heat and Mass Transfer，2005，48(9):1675.

［11］徐成海，張世偉，彭潤玲，等.真空冷凍干燥的現(xiàn)狀與展望(二)［J］.真空，2008，45(3):1－13.