韓 立，班付國，周紅霞，邱天寶，劉素梅，張躍京

(河南省獸藥監(jiān)察所，鄭州450008)

楊樹花為楊柳科植物毛白楊(Populus tomentosa Carr.)、加拿大楊(Populus canadensis Moench.)或同屬數(shù)種植物的干燥雄花序［1－2］，主要藥用成分為酚苷類化合物和黃酮類化合物［3－4］。楊樹花口服液是楊樹花經(jīng)提取制成的合劑，收載于《中國獸藥典》二○一○年版二部，每1 mL相當(dāng)于原生藥1 g，多為水提醇沉法生產(chǎn)［5］，具有清熱解毒、化濕止瀉的功效，主治濕熱下痢，幼畜泄瀉。在畜牧業(yè)中，楊樹花及其制劑廣泛應(yīng)用于羊、豬、兔等動(dòng)物的腹瀉、細(xì)菌性痢疾等疾?。?－8］。目前質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有理化鑒別，不能有效控制藥品質(zhì)量。因此研究楊樹花化學(xué)成分，定量測定活性成分含量，對(duì)于控制楊樹花口服液質(zhì)量具有重要的意義。水楊苷具有解熱鎮(zhèn)痛和苦味健胃助消化作用，是楊樹花口服液清熱健胃的主要有效成分，可溶于水，易溶于沸水，也是楊樹花口服液的主要活性成分。因此定量檢測楊樹花口服液中的水楊苷含量，有助于完善產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，指導(dǎo)生產(chǎn)，提高藥品質(zhì)量［9］。本試驗(yàn)以水楊苷為參照物，測定了楊樹花口服液中水楊苷的量，對(duì)于控制藥品質(zhì)量和完善標(biāo)準(zhǔn)很有實(shí)用性。

1 儀器與試劑

Waters Acquity UPLC超高效液相色譜儀(美國Waters公司)配置UPLC PDA光電二極管陣列檢測器/UPLC TUV紫外檢測器，Empower2色譜工作站采集數(shù)據(jù);METTLER TOLEDO XP205電子天平(十萬分之一，瑞士METTLER TOLEDO公司);Milli－Q Advantage A10超純水系統(tǒng)(美國 Millipore公司)。

甲醇(色譜純)，中性氧化鋁(層析用)，純化水，水楊苷對(duì)照品(含量 98.0%，批號(hào) 4.530013.0001，ANPEL Scientific instrument Co.Ltd.)。楊樹花口服液樣品 3批(批號(hào)分別為 12101101，12101102，12101103，均由 1家獸藥生產(chǎn)企業(yè)提供)。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測波長的選擇 采用DAD檢測器在210 nm～400 nm對(duì)對(duì)照品進(jìn)行全掃描(圖1)，水楊苷分別在212、268、339、384 nm 波長下有最大吸收，其中212 nm下吸收最大。分別比較4個(gè)波長下樣品的色譜圖，發(fā)現(xiàn)水楊苷雖然在212 nm下吸收最大，但是雜質(zhì)吸收也較大，而在268 nm～270 nm下有比較大的吸收，且峰形較好，基線平穩(wěn)，分離度較高，所以將檢測波長定為269 nm。

圖1 對(duì)照品光譜圖

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 流動(dòng)相為甲醇—水(10∶90);色譜柱:Waters XBridge C18，150 mm ×4.6 mm，5 μm;檢測波長 269 nm;流速1.0 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL;柱溫30 ℃。理論板數(shù)按水楊苷峰計(jì)算不低于3000，主峰的保留時(shí)間約為17.4 min(圖2－圖3)。

圖2 對(duì)照品色譜圖

圖3 楊樹花口服液色譜圖

2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取水楊苷對(duì)照品53.26 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇制成每mL含0.5326 mg 的溶液，過0.45 μm 微孔濾膜，即得水楊苷對(duì)照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備 精密量取楊樹花口服液2 mL，過中性氧化鋁柱(內(nèi)徑為1.5 cm，5 g)，收集流出液，再用40 mL水洗脫，流出液和洗脫液合并至50 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，作為供試品溶液。

2.5 線性關(guān)系考察 取水楊苷對(duì)照品適量，加水配制成含0.5 mg/mL的對(duì)照品溶液，分別稀釋成0.025、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/mL，精密量取 10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以水楊苷濃度為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，計(jì)算得回歸方程為:y＝1966x+15423，相關(guān)系數(shù) r=0.9995，結(jié)果表明水楊苷在 0.025～0.5 mg/mL 的濃度范圍內(nèi)，濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取水楊苷對(duì)照品溶液10 μL注入色譜儀，記錄色譜圖，連續(xù)進(jìn)樣6次測定峰面積。結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.52%，表明系統(tǒng)精密度符合要求。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品溶液，分別在樣品處理后的 0、1、2、8、12 h 進(jìn)樣，測定峰面積，考察樣品穩(wěn)定性。結(jié)果表明，供試品溶液12 h內(nèi)基本穩(wěn)定，RSD 為0.75%。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)為12101101的楊樹花口服液，精密量取2 mL，平行6份，依法進(jìn)行提取、測定，計(jì)算計(jì)算每份樣品中水楊苷的量，結(jié)果6份樣品中水楊苷的平均含量為3.3813 mg，RSD為0.76%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 回收率試驗(yàn) 取批號(hào)為12101101的楊樹花口服液，精密量取1 mL，平行6份，精密加入水楊苷對(duì)照品溶液5 mL(相當(dāng)于約2.6630 mg的水楊苷)，按照供試品溶液制備方法制成加樣供試品溶液，精密吸取加樣供試品溶液10 μL，按上述方法測定，計(jì)算回收率，結(jié)果表明，本法具有良好的回收率，見表1。

表1 水楊苷回收率試驗(yàn)

2.10 樣品的測定 取同一公司3批楊樹花口服液樣品，每批量取兩份，按供試品處理方法處理。取10 μL樣品溶液注入色譜儀，記錄色譜圖，平行進(jìn)樣兩次，計(jì)算平均含量。各批次樣品的含量見表2。

表2 樣品測定結(jié)果

3 討論與小結(jié)

3.1 樣品的凈化 試驗(yàn)比較了樣品過中性氧化鋁柱和不過中性氧化鋁柱的效果。發(fā)現(xiàn)不過中性氧化鋁柱時(shí)，供試品溶液顏色較深，進(jìn)樣后雜質(zhì)峰較多，很難與目的峰分離。當(dāng)樣品過中性氧化鋁柱后，供試品溶液顏色變淺，雜質(zhì)峰明顯減少，樣品的含量幾乎沒有變化?？梢酝茢?，色素等雜質(zhì)被中性氧化鋁吸附，但水楊苷基本都被洗脫下來。

3.2 樣品的含量 試驗(yàn)測定了同一公司3批樣品，水楊苷含量范圍為3.4 mg/mL左右。由于藥材來源不同，不同公司的生產(chǎn)工藝存在差異，楊樹花口服液中水楊苷含量相差可能較大。通過對(duì)自制的每1 mL相當(dāng)于原生藥1 g的楊樹花煎煮液進(jìn)行檢測，水楊苷含量達(dá)到10.8 mg/mL左右。參照《中國獸藥典》楊樹花口服液標(biāo)準(zhǔn)，有必要對(duì)楊樹花口服液中水楊苷的收率以及不同來源的楊樹花口服液中水楊苷含量進(jìn)行進(jìn)一步的測定和考察，以制定出合理的含量限度。

水楊苷是楊樹花口服液的主要成分和活性物質(zhì)，試驗(yàn)以水楊苷為定量目標(biāo)化合物，對(duì)于完善產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，提高藥品質(zhì)量具有現(xiàn)實(shí)意義。

［1］中國獸藥典委員會(huì).中華人民共和國獸藥典二○一○年版二部［S］.

［2］中國藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典一九七七年版一部［S］.

［3］梁延壽，張清芳.楊樹花化學(xué)成分的研究［J］.中藥通報(bào)，1988，13(1):41－42

［4］房春林.楊樹花及其復(fù)方制劑藥學(xué)與臨床應(yīng)用研究［D］.雅安:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

［5］楊海涵，房春林，李 超，等.楊樹花提取工藝研究［J］.中國動(dòng)物保健，2011，13(4)21－23.

［6］張玉果，郝智松.治療畜禽下痢的中藥:楊樹花口服液［J］.北方牧業(yè)，2013，43(16):29

［7］張玉果，郝智松.楊樹花口服液在治療豬腸炎中的臨床應(yīng)用［J］.獸藥市場指南，2013，(8):37

［8］潘繼蘭.楊樹花防治羔羊痢疾［J］.當(dāng)代畜禽養(yǎng)殖業(yè)，2005，(4):22

［9］李來生，黃偉東，何 琦，等.高效液相色譜法測定柳樹皮提取物中的水楊甙［J］.色譜，2001，19(5)446 －447