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WspR在大腸桿菌中的表達及其對c-di-GMP合成的影響*

2014-11-23 05:52:46凡責艷木佳毛自朝官會林
關鍵詞:離心管結構域質(zhì)粒

凡責艷, 木佳, 毛自朝, 官會林

(1.云南師范大學 能源與環(huán)境科學學院,云南 昆明650092;2.云南農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)業(yè)與生物技術學院,云南 昆明650201)

可得膠(curdlan),又稱熱凝膠,是農(nóng)桿菌ATCC31749菌株所產(chǎn)生的一種胞外多糖,由400~500個D-葡萄糖以β-(1→3)糖苷鍵線性連接而成的一類葡聚糖[1-2];由于其具有凝膠強度高、熱成型后不可逆、無色、無味和保水力強等特性,已被廣泛應用于農(nóng)業(yè)、建筑及化工行業(yè)等多個領域,在食品、化妝品等中用為添加劑;其抗HIV、抗腫瘤、提高免疫力活性等特性使其具有廣闊的醫(yī)用前景[3-4].目前全球可得膠產(chǎn)品約有60億美元的市場份額,并預計以每年10%左右的需求速度增長.相關研究發(fā)現(xiàn),大多數(shù)細菌胞外多糖的合成受控于新近發(fā)現(xiàn)環(huán)二鳥苷酸(c-di-GMP),該c-di-GMP是細菌中參與各種生理功能調(diào)節(jié)的第二信使[5-7],其合成及分解涉及三個蛋白質(zhì)域,其中GGDEF結構域為c-di-GMP合成中的二鳥核苷酸環(huán)化酶,而 EAL 和 HD-GYP域是c-di-GMP分解中的磷酸二酯酶[5,8-9].細菌中廣泛分布有 這三個結構域[5-6,9],具有GGDEF、EAL、及HDGYP結構域的蛋白質(zhì)參與到細菌纖維素生物合成、移動性、附著性、生物膜形成、毒力因子生產(chǎn)和致病 性[7-8,10-12].作為細菌中的第二信使,c-di-GMP除具有上述功能外,還能夠刺激胞外多糖的生物合成[13].大量研究表明,從綠膿桿菌(P.aeruginosa)中得到的類超化系統(tǒng)蛋白WspR具有GGDFE結構域,有DGC活性,可促進c-di-GMP的合成[14-17].生物信息學分析發(fā)現(xiàn),土壤農(nóng)桿菌ATCC31749含有十幾個GGDEF保守結構域[18].因此,如能在 ATCC31749中提高 WspR的表達活性,就能提高c-di-GMP的產(chǎn)生,從而促進胞外多糖可得膠的合成.本實驗將ATCC31749的WspR克隆到pQE81L,并轉(zhuǎn)入大腸桿菌,以確定WspR的表達是否可促進c-di-GMP的合成,下一步探究WspR在ATCC31749中作用及其對可得膠的合成調(diào)控研究提供基礎.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、質(zhì)粒

土壤農(nóng)桿菌 ATCC31749、WspR cDNA模板,大腸桿菌BL21(DE3),質(zhì)粒載體pQE81L,均由云南農(nóng)業(yè)大學生物化學與分子生物學實驗室提供.

1.1.2 酶和試劑

限制性內(nèi)切酶(SalI,BamHI)和 T4DNA連接酶購自Promega公司;Tap DNA聚合酶和dNTP購自TakaRa公司;血紅素、吖啶黃、ABTS(2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽)、30%過氧化氫購買于sigma公司,其他試劑均為分析純.

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成

根據(jù)GenBank中報道的pQE81L-WspR基因序列,設計合成含有相關酶切位點的上下游引物,并由上海生工生物工程有限公司合成.

1.2.2 目的基因的PCR擴增

根據(jù)pQE81L-WspR基因序列設計引物,上游引物:5′-GCGGATAACAATTTCACAC-3′;下游引物:5′-GCAGCACCAGGTTAGTTTCC-3′.PCR反應體系為:WspR 的cDNA 模板2.5 μL,10×PCR buffer 5 μL(含 Mg2+),2.5 mmol/L的dNTP 4μL,50μmol/L的上下游引物各1μL,5U/μL的Tap DNA聚合酶0.5μL,加去離子水至總體積為50μL.PCR反應程序:94℃ 預變性5min;94℃變性30s,55℃退火30 s,72℃延伸45s,共30個循環(huán);72℃延伸5 min.結束反應,PCR產(chǎn)物放置于4℃冰箱,留待電泳檢測.PCR產(chǎn)物的檢測:配制1%(w/v)的瓊脂糖凝膠,取5μL的PCR產(chǎn)物pQE81L-WspR同1μL的6×Loading buffer(1mL 6×Loading buffer混有25μL的花青素)混勻上樣,所用Marker為250bp-I DNA ladder.上樣后,凝膠于1×TAE緩沖液中,120V,電泳45min.電泳結束后使用IQuant capture凝膠成像分析系統(tǒng)拍照分析.

1.2.3 WspR蛋白表達的初步檢測

1.2.3.1 WspR蛋白的誘導表達

將凍存的含有pQE81L-WspR的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21菌株中,在LB含卡那霉素抗性固體平板上劃線活化,37℃溫箱倒置培養(yǎng)12~16h.挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中,于37℃恒溫搖床中200rpm振蕩過夜培養(yǎng).次日,按1∶100的比例,將種子液接種于LB液體培養(yǎng)基中,200 rpm,37 ℃振蕩培養(yǎng).待OD600達到0.5~1.0時,加入0.1mol/L的IPTG至終濃度為1mmol/L,之后低溫30℃,200rpm振蕩培養(yǎng).并在培養(yǎng)0,2,4,6h后分別取樣1mL,留作SDS-PAGE電泳檢測.

1.2.3.2 WspR誘導表達后粗蛋白樣品的處理

將誘導時所取的樣品12 000rpm離心5min,棄去上清液.用無菌去離子水清洗細胞沉淀,同樣12 000rpm離心,棄上清,并重復1次.按照0.2g/mL的比例加2×Loading Buffer(其中含5%的巰基乙醇),混勻.混勻后的樣品于沸水中煮15min,之后液氮速凍,如此重復3次.解凍后,12 000rpm 離心3min.留待SDS-PAGE檢測.

1.2.4 c-di-GMP的粗提取

將菌株BL21pQE81L-WspR、BL21 pQE81L分別用接種環(huán)蘸取一定量在已倒好的LB固體培養(yǎng)基上劃板培養(yǎng),37 ℃恒溫搖床中180rpm培養(yǎng)12h,然后分別在兩菌株平板上挑取一個單菌落接于5mL LB液體培養(yǎng)基中(培養(yǎng)菌株BL21pQE81L-WspR的培養(yǎng)基加入Amp抗生素,培養(yǎng)菌株BL21pQE81L的培養(yǎng)基加入Amp和Kan抗生素),37℃恒溫搖床中180rpm振蕩培養(yǎng)過夜;取1mL上述菌液接種于50mL LB培養(yǎng)基中,37℃恒溫搖床中180rpm振蕩培養(yǎng)4~6h,至 OD600值為0.4~0.6左右,停止培養(yǎng);在超菌臺上往培養(yǎng)基中加入0.1M的IPTG 250μL(最終濃度為0.5M)誘導,28℃搖床,180 rpm培養(yǎng)4h.

把上述誘導好的菌液分別用兩個50mL的離心管平均分裝成兩管(每管25mL),高速離心機4℃,12 000rpm離心15分鐘;倒掉上清液,沉淀用25mL的雙蒸水洗滌一次,4 ℃,12 000 rpm離心10分鐘后,再重復一次;倒掉上清液,用1mL 10mM Tris-HCl (pH 8.0,含100mM NaCl)溶液進行重懸;向懸浮液中加入25μL的25mg/mL的溶菌酶;將懸浮液用細胞破碎儀破碎細胞(2mm超聲探頭,50%功率)每次3s,間隙3s,30min,使外膜破裂,溶菌酶進入細胞壁;向溶液中加入60%的HClO4,至終濃度為20%,使懸浮液的大分子物質(zhì)沉淀;將懸浮液放置于冰上10min,用約1.5mL 3MKOH(含0.4M Tris和2MKCl)溶液中和至PH=7.0;再次用高速離心機12 000r/min,4℃離心10min;取上清液,用0.2μm濾膜的細菌過濾器進行過濾,即得到c-di-GMP粗提取品,將濾液用2mL的離心管保存在-80℃冰箱備用.

1.2.5 c-di-GMP的初步檢測

本過程分成對照組和實驗組:對照組加入菌株BL21pQE81Lc-di-GMP的粗提取物,實驗組加菌 株 BL21pQE81L-WspR 的 c-di-GMP 粗提物.

取四個無菌2.5mL的離心管,其中兩管里加入23ul的pQE81L,另外兩管兩管里加入23 μL的pQE81L-WspR,然后往四個離心管里各加入50mM Tris-HCl(pH 8.0,含100mM KCl)550μL,血紅素32.6μL混勻,放入水浴鍋中加熱至95℃,并保持5min;冷卻上述混合液至常溫,保持15min,分別往四個離心管里加入2.6 μL的吖啶黃,放入4 ℃冰箱12h;從冰箱里取出,分別往里面加入109.8μL ABTS,并放入16℃冰箱15min;然后加入5μL的30%的過氧化氫混勻,觀察各管內(nèi)顏色變化,即可檢測出c-di-GMP合成酶基因WspR在大腸桿菌中的表達情況.

2 結果與分析

2.1 質(zhì)粒pQE81L-WspR的構建

將質(zhì)粒載體pQE81L和目的基因片段WspR進行雙酶切,然后用T4DNA連接酶將載體和目的基因片段連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)得到重組質(zhì)粒,如圖1所示.

圖1 pQE81L-WspR質(zhì)粒構建流程Fig.1 The process of building plasmid pQE81L-WspR

2.2 PCR擴增檢測攜帶pQE81L-WspR的陽性轉(zhuǎn)化子

轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的質(zhì)粒pQE81L-WspR,經(jīng)菌落PCR擴增檢測呈陽性的克隆提取質(zhì)粒進行PCR鑒定,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測圖譜中呈現(xiàn)588bp左右的目的基因條帶,與預期結果一致,說明大腸桿菌BL21PQE81L已攜帶WspR的陽性轉(zhuǎn)化子,如圖2所示.

圖2 pQE81L-WspR的鑒定Fig.2 The identification of pQE81L-WspR

2.3 蛋白表達結果

通過SDS-PAGE凝膠電泳,可以初步確定蛋白表達圖譜上增加了一條40kD左右的條帶,為WspR蛋白,如圖3所示.

圖3 pQE81L-WspR在E.coli BL21菌株中的表達Fig.3 The expression of pQE81L-WspR in E.coli

2.4 c-di-GMP存在性檢測

根據(jù) c-di-GMP的檢測步驟,當加入血紅素時,pQE81L系列為無色,pQE81L-WspR系列為淺淺的紅綠色,如圖4所示;再加入吖啶黃時,pQE81L系列為淺淺的黃色,pQE81L-WspR系列為深黃色,如圖5所示;所有藥品加完時pQE81L系列為淺綠色,pQE81L-WspR系列為深綠色,如圖6所示.

上述實驗經(jīng)多次反復操作,顏色變化保持一致,表明大腸桿菌BL21pQE81L-WspR參與合成了 c-di-GMP,并且c-di-GMP氧化ABTS 為ABTS+離子,是整個溶液表現(xiàn)出ABTS+離子的顏色,即綠色.而大腸桿菌BL21pQE81L雖然也合成了c-di-GMP,使溶液表現(xiàn)淡淡的淺綠色,但相比WspR基因存在下合成的量卻很少.

綜上所述,WspR受體蛋白能促進大腸桿菌合成第二信使c-di-GMP,并且大大加速了c-di-GMP的合成量.

圖4 加入血紅素后的顏色變化Fig.4 The colour change after adding hemin

圖5 加入吖啶黃后的顏色變化 Fig.5 The colour change after adding acriflavine

圖6 加完ABTS和H2O2之后的顏色變化 Fig.6 The colour change after adding ABTS and H2O2

3 討 論

作為一個廣泛存在的第二信使-環(huán)二鳥苷酸(c-di-GMP),國內(nèi)外在有關代謝調(diào)控、細胞功能和信號傳導的作用等方面取得了重要的進展[19-23].但是目前對土壤農(nóng)桿菌 ATCC31749中c-di-GMP的調(diào)控機制目前還不清楚,而我們通過研究驗證WspR能在大腸桿菌中表達,并促進cdi-GMP大量表達,這為下一步研究 WspR在土壤農(nóng)桿菌ATCC31749中促進c-di-GMP合成提供基礎,進而為可得膠合成提供一定的依據(jù).

雖然我們初步證實了WspR受體蛋白能在大腸桿菌中促進c-di-GMP大量表達,但相關研究還有許多問題尚待解決:①合成c-di-GMP的影響因素、最佳條件、調(diào)控機制;②WspR能否在土壤農(nóng)桿菌ATCC31749中合成c-di-GMP并表達大量的胞外多糖可得膠;③尋找菌體內(nèi)c-di-GMP作用的靶點,但是還有許多細菌并不含有GEMM RNA,那么這些細菌中c-di-GMP第二信使傳導通路是否存在其他調(diào)節(jié)機制有待于進一步研究.未來的研究中,鑒定新的c-di-GMP調(diào)控是我們迫切需要解決的問題.

4 結 論

綠膿桿菌中得到的類趨化系統(tǒng)蛋白 WspR在大腸桿菌BL21中順利促進合成c-di-GMP,并且合成量能大大增加.而大腸桿菌是大量高效表達純化蛋白質(zhì)的模式菌株,這就為后期研究WspR受體蛋白在土壤農(nóng)桿菌ATCC31749中促進合成c-di-GMP,進而合成胞外多糖可得膠提供了確切可行的依據(jù).

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