羅云演， 張秋龍， 丁晨旭

（1.青海民族大學 化學與生命科學學院，青海 西寧810007；2.青海省青藏高原植物資源化學研究重點實驗室，青海 西寧810007；3.中國科學院 西北高原生物研究所，青海 西寧810001；4中國科學院 研究生院，北京100049）

多刺綠絨蒿（MeconopsishorridulaHook.f.＆ Thomson）為一年生罌粟科綠絨蒿屬草本植物，高約15～20cm，全株包被黃褐色或淡黃色堅硬而平展的刺，主要分布于中國青海、西藏、云南和甘肅，緬甸、印度東北部、不丹、錫金和尼泊爾也有分布，生長于海拔3 000～5 000米的山坡石縫中.多刺綠絨蒿味苦，有活血化瘀、止痛功效，主要用于治療頭傷、跌打損傷等癥［1－3］.通過查閱相關(guān)文獻［5－11］，綠絨蒿屬植物含有大量的黃酮類化合物，多刺綠絨蒿的化學成分主要為黃酮、生物堿和揮發(fā)油，其中以黃酮類化合物居多，而近年來的研究表明，黃酮類化合物具有廣泛的生物學活性［12－14］.

為了充分開發(fā)利用藏藥多刺綠絨蒿，本文運用響應(yīng)面分析法對多刺綠絨蒿總黃酮的提取條件進行優(yōu)化.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

T6新世紀紫外－可見分光光度計：北京譜析通用儀器有限責任公司生產(chǎn)；HH－6數(shù)顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；AL204電子天平：梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司.

多刺綠絨蒿，采自青海省海北門源地區(qū)，由當?shù)夭蒯t(yī)鑒定；蘆丁對照品：上海順勃生物工程有限公司（含量大于98%），批號：201203；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉和乙醇均為分析純.

1.2 標準曲線的制備

1.2.1 蘆丁貯備液配制

精密稱取蘆丁對照品8.75mg，用30%乙醇溶解于25mL容量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.35mg／mL貯備液.

1.2.2 制備標準曲線［4］

分別吸取貯備液0.0mL、0.5mL、1mL、1.5 mL、2mL、2.5mL，置于6個25mL容量瓶中，再分別用30%乙醇約定容至10mL，搖勻，隨后加入5%NaNO2溶液1.0mL，搖勻，靜置4min，加入 10%Al（NO3）3溶液1.0mL，搖勻，靜置10 min，加入1mol／L NaOH 溶液5mL，搖勻，最后30%乙醇定容至刻度，充分混勻，放置15min，得相應(yīng)濃度的對照品溶液.500nm處測吸光度值，以該系列中1號對照品液（0mg／mL）為參比，蘆丁濃度C（mg／mL）為橫坐標，相應(yīng)的吸光度值A(chǔ)為縱坐標，作標準曲線，得標準曲線方程為：y＝20.614x＋0.000 1，R2＝0.999 2.

1.3 多刺綠絨蒿中總黃酮的提取

稱取多刺綠絨蒿藥材粉末（過40目篩）1g，加入60%乙醇25mL，超聲5min，后于70℃熱回流70min，提取2次，合并濾液.濃縮濾液，并用30%乙醇10mL溶解，精密量取0.5mL于25mL容量瓶中，按“1.2.2”項下方法操作，測量吸光度.

1.4 多刺綠絨蒿中總黃酮的提取工藝設(shè)計

選擇乙醇濃度（A）、液料比（B）和提取時間（C）等影響總黃酮提取率較大的因素，并根據(jù)影響多刺綠絨蒿中總黃酮提取因素考察試驗的結(jié)果選擇相應(yīng)的實驗水平.采用Design expert.V.8.0.6軟件中Box－Behnken中心組合實驗設(shè)計三因素三水平方案，以多刺綠絨蒿總黃酮提取率為考察指標，通過軟件分析得出提取多刺綠絨蒿中總黃酮的最優(yōu)工藝參數(shù).實驗設(shè)計見表1.

表1 中心組合設(shè)計表Table 1 The central composite design

2 結(jié)果與分析

2.1 影響多刺綠絨蒿中總黃酮提取因素考察試驗

2.1.1 乙醇濃度考察試驗

稱取藥材粉末1g，按“1.3”項下方法，于70℃，料液比1∶25的條件下，乙醇濃度分別為40%、50%、60%、70% 和 80%，熱回流提取70min，考察試驗結(jié)果如圖1所示.

圖1 乙醇溶液濃度考察試驗結(jié)果Fig.1 The test results of ethanol concentration

由圖1可知，在乙醇濃度小于60%時，提取率隨著乙醇濃度的增大而增大，當乙醇濃度大于60%時，提取率反而隨之下降，且葉綠素等物質(zhì)的溶出增加，不利于測定，故選擇乙醇濃度為60%左右.

2.1.2 液料比考察試驗

稱取藥材粉末1g，按“1.3”項下方法，于70℃，乙醇濃度60%條件下，液料比分別為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1和30∶1，熱回流提取70 min，考察試驗結(jié)果如圖2所示.

圖2 液料比考察試驗結(jié)果Fig.2 The test results of ratio of liquid to solid

由圖2可以看出，當液料比達到20∶1左右時，隨著提取劑用量增加，提取率變化不大，而25∶1之后，可能是雜質(zhì)的溶出增加，影響了總黃酮的溶出，提取率故略有所下降，所以選擇液料比為25∶1左右.

2.1.3 提取時間考察試驗

稱取藥材粉末1g，按“1.3”項下方法，于70℃，乙醇濃度60%，液料比25∶1條件下，分別熱回流提取50min、60min、70min、80min和90min，考察試驗結(jié)果如圖3所示.

圖3 提取時間考察試驗結(jié)果Fig.3 The test results of extracting time

由圖3可知，提取時間在由50min逐漸上升至70min時，總黃酮提取率顯著增加，而70min后，隨著提取時間的延長提取率有所下降，可能是多刺綠絨蒿中黃酮類物質(zhì)結(jié)構(gòu)對熱具有一定的不穩(wěn)定性，故選擇提取時間為70min左右.

2.1.4 提取溫度考察試驗

圖4 提取溫度考察試驗結(jié)果Fig.4 The test results of temperature

稱取藥材粉末1g，按“1.3”項下方法，于乙醇濃度60%，液料比25∶1條件下，分別于40℃、50℃、60℃、70℃和80℃水浴中浸提70min，考察試驗結(jié)果如圖4所示.

由圖4可見，70℃以后，隨著提取溫度的升高，提取率有所下降，可能是多刺綠絨蒿中黃酮類物質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到破壞所致，另一方面雜質(zhì)的溶出量增加，影響測定，所以選擇提取溫度為70℃左右.

2.2 響應(yīng)面實驗方案與相關(guān)數(shù)據(jù)分析結(jié)果

本文采用 DesignExpert.V.8.0.6軟件，對表2中響應(yīng)面實驗數(shù)據(jù)進行分析，得出回歸方程方差分析表及相應(yīng)的響應(yīng)曲面圖.

表2 響應(yīng)面實驗方案及實驗結(jié)果Table 2 The experiment designs and results of RSM

響應(yīng)面軟件程序?qū)Ρ?中實驗結(jié)果進行二次回歸響應(yīng)面分析，得到的回歸方程：多刺綠絨蒿總黃酮的提取率＝1.41＋0.10＊A＋0.058＊B－0.091＊C－0.043＊A＊B＋0.023＊A＊C－0.020＊B＊C－0.061＊A2＋0.022＊B2－0.079＊C2

表3 回歸方程方差分析表Table 3 ANOVA for quadratic polynomial model

由表3可知，三個因素對提取率影響優(yōu)先順序為：乙醇濃度＞液料比＞提取時間，回歸模型P值小于0.000 1達到極顯著水平，方程相關(guān)系數(shù)R2＝0.925 9，說明該模型擬合度較好，失擬項P＝0.947 4（P＞0.1）不顯著，表明本實驗所得二次回歸方程高度顯著，實驗設(shè)計可靠.兩因素交互作用對總黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖如圖5－7.

圖5 乙醇濃度與液料比交互作用對總黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface curve for extraction yield of total flavonoids showing interaction between concentration of ethanol and ratio of liquid to solid

圖6 乙醇濃度與提取時間交互作用對總黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface curve for extraction yield of total flavonoids showing interaction between concentration of ethanol and extracting time

圖7 液料比與提取時間交互作用對總黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface curve for extraction yield of total flavonoids showing interaction between ratio of liquid to solid and extracting time

3 驗證實驗

為了驗證根據(jù)模型優(yōu)化條件得到的最佳理論工藝條件（乙醇濃度64.36%、液料比29.88∶1，提取時間66.01min時，總黃酮提取率理論值為1.530%）的可靠性，實際操作中將工藝修正為乙醇濃度64%、液料比30∶1和提取時間66min進行實驗，總黃酮得率為1.521%（n＝3，RSD＝0.399%）與預(yù)測值相差不大.

4 結(jié) 論

采用響應(yīng)面法優(yōu)化乙醇熱回流提取多刺綠絨蒿中總黃酮，得出最優(yōu)工藝條件為乙醇濃度64%，液料比30∶1，提取時間66min，經(jīng)檢驗，在此工藝條件下，總黃酮提取率為1.521%（n＝3），與預(yù)測值相差不大，表明該模型是合理可靠的，具有一定的應(yīng)用價值.

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