石利民+何敏+喬夢凱+雍瑋+曾理+王璇+張洪英+丁潔

【摘要】 目的：分析發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒感染（SFTSV）感染患者的臨床特點、流行病學以及SFTSV基因序列。方法：收集本市2014年4-6月某醫(yī)院送檢的2例重癥發(fā)熱伴血小板減少（SFTS）患者的血清標本，經(jīng)核酸熒光PCR檢測陽性確診。對病毒核酸測序并與GenBank數(shù)據(jù)比對。結(jié)果：兩名患者均有典型的SFTSV感染的臨床癥狀，以發(fā)熱、腹瀉為首發(fā)癥狀，血常規(guī)見粒系及血小板呈進行性降低。從2例患者血清提取的核酸經(jīng)測序，其基因序列與GenBank中的SFTSV進行比對，0428株（安慶）的RNA多聚酶、糖蛋白、NS蛋白的同源性與安徽代表株AHL/China/2011的同源性最高，均達到99%。0507株（滁州）上述目的基因與江蘇株JS2011-013-1的同源性高達99%。結(jié)論：SFTSV在本地區(qū)散發(fā)存在，基因序列分析結(jié)果提示其來源或有差異。

【關(guān)鍵詞】 布尼亞病毒感染； 發(fā)熱； 血小板減少； 基因； 病毒； 序列分析

Viral Sequence Analysis of Two Cases with SFTSV Infections/SHI Li-min， HE Min， QIAO Meng-kai， et al.//Medical Innovation of China，2014，11（31）：018-020

【Abstract】 Objective： To investigate the clinical characteristics and epidemiology of patients infected with severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus （SFTSV） and the genetic background of the SFTSV. Method： Clinical and epidemiological data of two cases with severe fever with thrombocytopenia syndrome （SFTS）， collected from a hospital in Nanjing during April 2014 to June 2014， were retrospectively analyzed. Nucleic acid was extracted from the serum of the two SFTSV cases. After specific polymerase chain reaction（PCR）， the nucleic acid sequences were compared with those in GenBank using the BLAST facility. Result： Two patients presented typical clinical symptoms of SFTSV infection， with acute onset of fever and diarrhea. Routine blood examination showed that neutrophils and platelets progressively decreased. The results of alignment with database in GenBank， showed that RNA-dependent RNA polymerase gene， the glycoprotein gene and NS protein gene of the sample 0428（Anqing） had 99% homology with AHL/China/2011， the representative strain of AnHui Province. While the genes of sample 0507（Chuzhou） had 99% homology with JS2011-013-1， the representative strain of JiangSu Province. Conclusion： The results suggest that SFTSV occur sporadically in Nanjing and its origin might be diverse.

【Key words】 SFTS bunyavirus； Fever； Thrombocytopenia syndrome； Gene； Viral； Sequence analysis

First-authors address： Nanjing Municipal Center for Disease Control and Prevention， Nanjing 210003， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.31.006

發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒（Severe Fever With Thrombocytopenia Syndrome Bunyavirus， SFTSV）是我國2010年新發(fā)現(xiàn)的布尼亞病毒科白蛉病毒屬的新病毒。SFTSV感染主要導致發(fā)熱伴血小板減少綜合征（severe fever with thrombocytopenia syndrome， SFTS），引起以發(fā)熱伴血小板、白細胞減少、嚴重的胃腸道癥狀、淺表淋巴結(jié)腫大為主要特征的臨床癥狀，是一種新發(fā)傳染病，患者可因多臟器功能衰竭而死亡，病死率較高。河南、湖北、山東、安徽、遼寧、江蘇等省均已出現(xiàn)該病病例[1-2]。新型布尼亞病毒可能為一種由蜱傳播的自然疫源性疾病[3-6]，螨類、鼠類與人群發(fā)病之間應有一定的聯(lián)系[7]，但其在自然界中的循環(huán)傳播模式尚不完全清楚。江蘇省丘陵地區(qū)總面積占全省總面積的15%，造成江蘇SFTSV流行的主要原因可能是因為其地貌特點[8]。2014年4-5月，兩名安徽患者就診于南京某醫(yī)院，筆者對其開展了流行病學調(diào)查和實驗室病原學檢測，采用實時熒光定量RT-PCR及產(chǎn)物測序?qū)Σ寄醽啿《竞怂徇M行鑒定和分子進化分析。

1 資料與方法

1.1 流行病學資料 2014年4-5月，南京某醫(yī)院收治兩名SFTS患者，均為男性，年齡分別為62歲和77歲，來自安徽兩個城市的不同鄉(xiāng)村，職業(yè)均為農(nóng)民，居住地為丘陵或山區(qū)，均無疫區(qū)居留史，均無布尼亞病毒陽性患者接觸史。蜱蟲叮咬史均不詳。其中一名患者發(fā)病前兩周有采茶經(jīng)歷，另一名患者發(fā)病前兩周有種地、割草史。

1.2 臨床特征 2名患者均以發(fā)熱、腹瀉為首發(fā)癥狀。其中一名患者皮膚見瘀點和瘀斑。

1.3 實驗室檢查 血常規(guī)見粒系及血小板呈進行性降低，其中WBC下降至（0.88～1.47）×109/L，PLT最低為40×109/L，血液生物化學檢測酶譜較高，包括轉(zhuǎn)氨酶、乳酸脫氫酶、肌酸激酶等均明顯升高，腎功能損害，肌酐升高，低鈣血癥。

1.4 病原學檢查 從患者血清提取病毒核酸，使用臺塑公司組織RNA全自動萃取試劑盒提取RNA，按試劑盒說明書操作。實時熒光定量PCR檢測：S-F： GGGTCCCTGAAGGAGTTGTAAA，S-R： TGCCTTCACCAAGACTATCAATGT，探針：FAM-TTCTGTCTTGCTGGCTCCGCGC（引物序列由江蘇省疾控中心提供）。PCR反應體系用QIAGEN公司的QuantiTect? Probe RT-PCR Kit（Cat.No 20443）試劑盒配制。擴增反應條件：反轉(zhuǎn)錄50 ℃ 30 min；變性95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃40 s；擴增40個循環(huán)。標準模式為每個循環(huán)60 ℃ 40 s時收集熒光。Ct值≤37且有對數(shù)增長曲線的為擴增陽性，Ct值>37且有對數(shù)增長曲線需重復實驗，仍有數(shù)增長曲線的為擴增陽性，無對數(shù)增長曲線的為擴增陰性。反應在ABI 7500 fast 熒光定量PCR 儀上進行。分析軟件為SDS v1.3.2。

1.5 序列測定 用參考文獻[9-10]所述方法對布尼亞病毒基因組依賴RNA的RNA聚合酶、糖蛋白、N蛋白以及核衣殼蛋白區(qū)域進行RT-PCR擴增，引物具體序列如下：bun rdrp-S：5'-ATGGACAACCCTGCATTCG-3，bun rdrp-AS： TCAGCTTCTAGGCTAAAACCAG；bun gly 601-S：AAGAGTTTTAGCCAAAGTGAATTCCC，bun gly 1753-AS：ACATTCCTTCATATTTCCGCTCCC；bun NS 1043-S：CTTCAGCCACTTCACCCGAAC，bun NS 1646-AS：GCAGCAGCTCAATTTGACT。由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。反應采用Takara公司的Primer-Script one step RT-PCR kit Ver.2進行反應，反應步驟如下：取標本2 μL，體系為20 μL， 其中2×1 Step Buffer 10 μL， Taq 酶0.8 μL，步驟為50 ℃ 30 min，94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 60 s， 72 ℃ 7 min延長，35 cycles。PCR 產(chǎn)物用QIAXCEL毛細管電泳儀觀察結(jié)果。

1.6 序列測定和分析 將PCR陽性產(chǎn)物送金斯瑞（南京）科技有限公司純化和測序。從GenBank的核酸序列數(shù)據(jù)庫中下載SFTSV的核酸序列片段，將下載序列同本研究檢測到的序列利用GenBank進行序列比對和同源性分析。

2 結(jié)果

2.1 對比結(jié)果 0428株和0507株均獲得1000 bp的依賴RNA的RNA聚合酶條帶、1156 bp的糖蛋白條帶和537 bp的N蛋白條帶，見圖1。

2.2 在GenBank上進行序列比對和同源性分析的結(jié)果 布尼亞病毒（0428）的序列比對結(jié)果：依賴RNA的RNA聚合酶基因、糖蛋白基因、非結(jié)構(gòu)蛋白基因與GenBank中安徽株AHL/China/2011的L大片段（Accesion JQ670934.1）、M片段（JQ670930.1）、S片段（JQ670932.1）同源性分別達99%、99%、99%，與河南株HNXY_212的L大片段（KC292327.1）、M片段（KC292300.1）、S片段（KC292273.1）同源性分別達96%、96%、98%，與江蘇株JS2011-109的L大片段（KC505138.1）、M片段（KC505139.1），S片段（KC505140.1）同源性分別達95%、97%、98%。

另一株布尼亞病毒（0507）的序列比對結(jié)果：依賴RNA的RNA聚合酶基因、糖蛋白基因、非結(jié)構(gòu)蛋白基因與江蘇株JS2011-013-1的L大片段（Accesion KC505126.1）、M片段（Accesion KC505127.1）、S 片段（KC505128.1）同源性分別達99%、99%、99%，與河南株HNXY_212的L大片段（KC292327.1）、M片段（KC292300.1）、S片段（KC292273.1）同源性分別達96%、95%、95%，與安徽株AHL/China/2011的L大片段（Accesion JQ670934.1）、M片段（JQ670930.1）、S片段（JQ670932.1）同源性分別達95%、95%、96%。

3 討論

SFTSV屬于布尼亞病毒科白蛉病毒屬，病毒顆粒為具包膜的球形，直徑80～100 nm，主要分布在細胞內(nèi)微粒體，表面有糖蛋白突起等?；蚪M含3個單股負鏈RNA片段，分別為L、M和S片段，L片段全長為6368個核苷酸，包含單一讀碼框架編碼RNA依賴的RNA聚合酶；M片段全長為3378個核苷酸，含有單一的讀碼框架，編碼1073個氨基酸的糖蛋白前體；S片段是一個雙義RNA，基因組以雙向的方式編碼病毒核蛋白（NP）和非結(jié)構(gòu)蛋白[11]。盧靜等對SFTSV結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白的表達研究發(fā)現(xiàn)，NP蛋白抗原性很強，SFTS病人血清中NP特異性抗體可能為主要抗體。而NSs患者血清中不誘導產(chǎn)生抗體或僅產(chǎn)生極少的抗體，很難被檢測到[12]。

本次研究的兩個病例從流行病學上看，均為來自安徽農(nóng)村，但是序列分析結(jié)果顯示其來源可能不同。0428株（安慶）的RNA多聚酶、糖蛋白、NS蛋白的同源性與安徽代表株AHL/China/2011的同源性最高，均達到99%。而0507株（滁州）的RNA多聚酶、糖蛋白、NS蛋白與AHL/China/2011同源性分別僅為95%、95%、96%，而與江蘇株JS2011-013-1的同源性高達99%。地理位置上看，滁州為蘇皖交匯地區(qū)，與南京接壤，因此來自滁州的患者感染的布尼亞病毒可能來自江蘇，因而與江蘇代表株的同源性最高[13-15]。

此外，序列分析結(jié)果還提示，不同來源的SFTSV的RNA依賴RNA聚合酶（RNA-P）和糖蛋白基因存在一定差異，且其差異的顯著性優(yōu)于NS基因。本研究為本地區(qū)SFTSV分子流行病學研究提供了基礎(chǔ)。

參考文獻

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（收稿日期：2014-07-14） （本文編輯：王宇）

本次研究的兩個病例從流行病學上看，均為來自安徽農(nóng)村，但是序列分析結(jié)果顯示其來源可能不同。0428株（安慶）的RNA多聚酶、糖蛋白、NS蛋白的同源性與安徽代表株AHL/China/2011的同源性最高，均達到99%。而0507株（滁州）的RNA多聚酶、糖蛋白、NS蛋白與AHL/China/2011同源性分別僅為95%、95%、96%，而與江蘇株JS2011-013-1的同源性高達99%。地理位置上看，滁州為蘇皖交匯地區(qū)，與南京接壤，因此來自滁州的患者感染的布尼亞病毒可能來自江蘇，因而與江蘇代表株的同源性最高[13-15]。

此外，序列分析結(jié)果還提示，不同來源的SFTSV的RNA依賴RNA聚合酶（RNA-P）和糖蛋白基因存在一定差異，且其差異的顯著性優(yōu)于NS基因。本研究為本地區(qū)SFTSV分子流行病學研究提供了基礎(chǔ)。

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[10]李世波，薛川，丁賢君，等.浙江地區(qū)散發(fā)新型布尼亞病毒感染患者的臨床特點及其基因序列[J].中華傳染病雜志，2012，30（5）：268-272.

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[12]盧靜，李川，李福順，等.發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白表達研究[J].病毒學報，2011，1（6）：515-520.

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（收稿日期：2014-07-14） （本文編輯：王宇）

本次研究的兩個病例從流行病學上看，均為來自安徽農(nóng)村，但是序列分析結(jié)果顯示其來源可能不同。0428株（安慶）的RNA多聚酶、糖蛋白、NS蛋白的同源性與安徽代表株AHL/China/2011的同源性最高，均達到99%。而0507株（滁州）的RNA多聚酶、糖蛋白、NS蛋白與AHL/China/2011同源性分別僅為95%、95%、96%，而與江蘇株JS2011-013-1的同源性高達99%。地理位置上看，滁州為蘇皖交匯地區(qū)，與南京接壤，因此來自滁州的患者感染的布尼亞病毒可能來自江蘇，因而與江蘇代表株的同源性最高[13-15]。

此外，序列分析結(jié)果還提示，不同來源的SFTSV的RNA依賴RNA聚合酶（RNA-P）和糖蛋白基因存在一定差異，且其差異的顯著性優(yōu)于NS基因。本研究為本地區(qū)SFTSV分子流行病學研究提供了基礎(chǔ)。

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[9]陳華忠，王金富，梁偉峰，等.浙江省首例新型布尼亞病毒感染患者的流行病學調(diào)查[J].國際流行病學傳染病學雜志，2012，38（5）：360-360.

[10]李世波，薛川，丁賢君，等.浙江地區(qū)散發(fā)新型布尼亞病毒感染患者的臨床特點及其基因序列[J].中華傳染病雜志，2012，30（5）：268-272.

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（收稿日期：2014-07-14） （本文編輯：王宇）