顧大業(yè)，王成永，汪洪湖，陳文婕，戴榮歡

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，合肥230001；2.安徽蚌埠豐原醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，安徽 蚌埠233000）

門冬氨酸鳥氨酸注射液于20世紀(jì)70年代最先在德國(guó)應(yīng)用于臨床，于1991年收載入德國(guó)藥典，同時(shí)并被美國(guó)FDA 批準(zhǔn)用于治療肝性腦病。門冬氨酸鳥氨酸是由門冬氨酸與鳥氨酸聚合形成穩(wěn)定的二肽聚合物，鳥氨酸是通過(guò)肝臟鳥氨酸循環(huán)來(lái)加速尿素的合成，促進(jìn)氨的代謝，因而達(dá)到降低血氨濃度。天門冬氨酸則是間接參與三羧酸循環(huán)以及核酸的合成，從而有利于對(duì)受損肝細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)，也促進(jìn)了肝細(xì)胞內(nèi)的能量生成［1］。門冬氨酸鳥氨酸注射液在我國(guó)也是首個(gè)用于臨床具有解毒、護(hù)肝、能量三效合一的新藥，其主要有效成分是門冬氨酸鳥氨酸，化學(xué)名稱為（S）－2，5－二氨基戊酸（s）－2－氨基丁二酸鹽，分子式：C9H19N3O6，相對(duì)分子質(zhì)量：265.27［2］。臨床主要應(yīng)用于急、慢性肝病的治療，其包括肝硬化、脂肪肝以及肝炎所引起的血氨升高癥狀，其中對(duì)肝性腦病尤其有效［3］。

一 材料與方法

為篩選優(yōu)化工藝參數(shù)，實(shí)驗(yàn)以溶液PH 值、配液溫度以及充氮壓力為考察因素，以樣品中門冬氨酸鳥氨酸和鳥氨酸內(nèi)酰胺鹽的含量為考察指標(biāo)，，選用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，優(yōu)選出該注射液的最佳配制工藝參數(shù)，按照篩選出的最佳工藝參數(shù)配制出的樣品經(jīng)留樣觀察和儀器分析檢測(cè)表明各項(xiàng)指標(biāo)均符合門冬氨酸鳥氨酸注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，從而確保了該產(chǎn)品的質(zhì)量可靠與穩(wěn)定。

試藥及物料。門冬氨酸鳥氨酸原料藥（批號(hào)：120824，含量：99.62%，水分3.2%，自制）；門冬氨酸鳥氨酸對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所），鳥氨酸內(nèi)酰胺鹽對(duì)照品（120827，自制），氨水（江蘇彤晟化學(xué)試劑有限公司，分析純）；磷酸（江蘇強(qiáng)盛化工有限公司，分析純）；乙腈（分析純），微孔濾膜（0.22um，PALL公司）；玻璃安瓿（10mL棕色，兆豐（丹陽(yáng)）新型藥用包材有限公司）。

儀器及設(shè)備。磁力攪拌器（江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠），KQ3200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；安瓿拉絲灌封機(jī)（上海遠(yuǎn)東制藥機(jī)械總廠）；TU－1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；高效液相色譜儀（waters）。

二 配置方法

（一）考察指標(biāo)的確定與檢測(cè)方法

通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)和一些預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，門冬氨酸鳥氨酸在偏堿的溶液體系中鳥氨酸會(huì)降解，引起鳥氨酸內(nèi)酰胺鹽增加。又根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，門冬氨酸鳥氨酸隨著溫度升高顏色加深，含量降低且鳥氨酸內(nèi)酰胺鹽增加。所以選擇門冬氨酸鳥氨酸含量和鳥氨酸內(nèi)酰胺鹽為主要考察指標(biāo)，參照國(guó)家藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)YBH04442011門冬氨酸鳥氨酸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，采用HPLC法測(cè)定注射液樣品中門冬氨酸鳥氨酸含量和鳥氨酸內(nèi)酰胺鹽。

（二）相關(guān)因素與水平的確定

通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)和一些預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，配制溶液溫度越高，門冬氨酸鳥氨酸溶解越完全，但溫度過(guò)高，不利于主藥的穩(wěn)定。充氮量越少，溶液中的殘留空氣越多，越不利于主藥穩(wěn)定，但通氮量過(guò)大，會(huì)引起溶液溫度迅速下降，也不利于主藥完全溶解，故影響其含量。PH 值越大，鳥氨酸越不穩(wěn)定，雜質(zhì)含量也越偏高。因此，結(jié)合原有工藝參數(shù)，選取注射液配制時(shí)的PH 值、溫度以及充氮壓力為考察因素，每個(gè)因素選三個(gè)水平進(jìn)行L9（34）正交表平行試驗(yàn)，采用綜合評(píng)分法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析（其權(quán)重系數(shù)分別為0.6，0.4），優(yōu)選最佳配液工藝，因素水平見表1。

表1 因素水平

（三）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

按照正交設(shè)計(jì)的試驗(yàn)條件來(lái)進(jìn)行樣品的配制，稱取門冬氨酸鳥氨酸約100g若干份，分別置250ml燒杯中加入100ml注射用水放入相應(yīng)溫度的水浴鍋中勻速攪拌30min至全溶，然后定容至200ml，樣品配制好后進(jìn)行過(guò)濾、灌封、滅菌，然后留樣觀察，并按國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局門冬氨酸鳥氨酸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)門冬氨酸鳥氨酸與鳥氨酸內(nèi)酰胺鹽的含量。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1，試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3。

（四）門冬氨酸鳥氨酸及鳥氨酸內(nèi)酰胺鹽含量的測(cè)定［4，5］

色譜條件。Waters 1525－2487－TCM－717Alltima Amino色譜柱（4.6mm×250mm，5 um）；流動(dòng)相：乙腈－0.05mol／L 磷酸二氫鉀溶液（50∶50）；檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm；流速：1.0mL／min；柱溫：30 ℃。

對(duì)照品溶液的制備。取門冬氨酸鳥氨酸對(duì)照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成每毫升含1mg的溶液，即得對(duì)照品溶液。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析表

供試品溶液的制備。精密量取門冬氨酸鳥氨酸注射液0.2ml，置100ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

含量測(cè)定。精密量取供試品和對(duì)照品20ul注入HPLC儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算門冬氨酸鳥氨酸含量，面積歸一化法計(jì)算鳥氨酸內(nèi)酰胺鹽含量。

（1）式中：As為供試品中門冬氨酸鳥氨酸的峰面積；Cr為門冬氨酸鳥氨酸對(duì)照品的濃度，mg／ml；Ar為對(duì)照品中門冬氨酸鳥氨酸的峰面積；Cs為供試品中門冬氨酸鳥氨酸的標(biāo)示濃度，mg／ml。

三 結(jié)果分析

通過(guò)對(duì)表2直觀分析表明，以綜合評(píng)分為標(biāo)準(zhǔn)，在所選的因素水平范圍內(nèi)，各因素作用順序?yàn)锽＞A＞C，最佳提取組合為：A1B3C2，即：溶解溫度為40°，PH 值為6.0，充氮壓力為0.6 MPa。通過(guò)對(duì)表3的方差分析表明，只有因素C（充氮壓力）有顯著性影響（P＜0.05），而因素A（溶解溫度）、因素B（PH 值）對(duì)試驗(yàn)結(jié)果均無(wú)顯著影響（P＞0.05），考慮到生產(chǎn)上的節(jié)能和經(jīng)濟(jì)性問(wèn)題，優(yōu)選因素水平組合為A1B2C2，即溶解溫度為40°，PH值為6.0，充氮壓力為0.6MPa。

四 最佳工藝驗(yàn)證

分別稱取5份門冬氨酸鳥氨酸原料藥約100g置250ml燒杯中加100ml純化水至40°水浴鍋上加熱攪拌30min后冷卻，然后定容至200ml，用1mol／L NaoH－HCL 調(diào)PH 到6.0，再過(guò)濾充氮灌封，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明門鳥平均含量為100.93%；鳥氨酸內(nèi)酰胺鹽的平均含量為0.397%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)表4工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明5個(gè)平行樣門冬氨酸鳥氨酸含量的RSD 為0.371%小于限度2%，鳥氨酸內(nèi)酰胺鹽含量的RSD 為0.808%小于限度20%，因此表明該方案A1B2C2的重現(xiàn)性較好，說(shuō)明此小試工藝的條件穩(wěn)定可行。

五 討論

門冬氨酸鳥氨酸是由鳥氨酸和天門冬氨酸通過(guò)成鹽反應(yīng)生成的二肽聚合物，其性質(zhì)不穩(wěn)定，注射液在高溫、光照、偏堿環(huán)境中鳥氨酸易成環(huán)，顏色加深，導(dǎo)致含量降低，雜質(zhì)偏大。因此優(yōu)選適宜的配制工藝參數(shù)對(duì)其質(zhì)量影響作用重大，本文是通過(guò)正交試驗(yàn)法優(yōu)選出了門冬氨酸鳥氨酸注射液配制工藝參數(shù)，按篩選出的工藝條件來(lái)制備樣品并檢測(cè)樣品中門冬氨酸鳥氨酸含量和鳥氨酸內(nèi)酰胺鹽量，結(jié)果顯示根據(jù)篩選的工藝參數(shù)配制的注射液性質(zhì)穩(wěn)定，質(zhì)量可靠。

本研究是從優(yōu)化工藝參數(shù)的角度來(lái)進(jìn)行篩選，可用于指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)。但改善門冬氨酸鳥氨酸注射液的質(zhì)量還可以從篩選處方著手。因?yàn)殚T冬氨酸鳥氨酸注射液長(zhǎng)期貯存有不穩(wěn)定現(xiàn)象，所以可以考慮通過(guò)加入合適的PH 調(diào)節(jié)劑和抗氧劑來(lái)提高溶液的穩(wěn)定性。故可以通過(guò)對(duì)門冬氨酸鳥氨酸注射液的處方和生產(chǎn)工藝來(lái)進(jìn)行優(yōu)化，解決產(chǎn)品在貯存過(guò)程中的不穩(wěn)定現(xiàn)象，甚至可以耐受終端滅菌等現(xiàn)實(shí)問(wèn)題，將有利于提高門冬氨酸鳥氨酸注射液的品質(zhì)。

［1］陳孝治.瑞甘［J］.中南藥學(xué)，2004，2（4）：254－255.

［2］蔣音，陳良，巫善明.門冬氨酸鳥氨酸的藥理作用與臨床應(yīng)用［J］.世界感染雜志，2007，7（5）：415－418.

［3］何昌武，張彥秋.門冬氨酸－鳥氨酸治療病毒性肝炎膽紅素升高的療效觀察［J］.中國(guó)自然醫(yī)學(xué)雜志，2009，11（1）：74－75.

［4］王榮梅.高效液相色譜法測(cè)定鹽酸精氨酸注射液的含量［J］.中國(guó)生化藥物雜志，2003，24（6）：296－297.

［5］繆寧梅，馬婕.高效液相色譜法測(cè)定門冬氨酸鳥氨酸注射液的含量［J］.中國(guó)生化藥物雜志，2007，28（1）：52－53.