趙銘佳，周善杰，袁冬，邱實(shí)，楊鎰魟，楊向祎，周芳，盧文紅，梁曉薇，谷翊群＊

（1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730；2.國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委男性生殖健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家人口計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081）

血清同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）是體內(nèi)甲硫氨酸循環(huán)的正常代謝產(chǎn)物，是許多需甲基化反應(yīng)和能量代謝的重要中間產(chǎn)物。許多學(xué)者做了大量關(guān)于血清Hcy與心腦血管疾病關(guān)聯(lián)性研究，認(rèn)為血清Hcy增高是動(dòng)脈硬化的危險(xiǎn)因子［1］。高血清Hcy還與某些內(nèi)分泌疾病、腫瘤疾病、自身免疫性疾病以及神經(jīng)退行性疾病有關(guān)系［2］。近些年越來(lái)越多的證據(jù)表明，Hcy代謝途徑在生育力方面占有非常重要的地位［3，4］。本研究旨在探討建立精漿Hcy的正常值參考范圍，血清、精漿Hcy，精漿Hcy總含量與精液參數(shù)的關(guān)聯(lián)性以及精漿Hcy濃度與血清Hcy濃度關(guān)聯(lián)性的研究。

材料和方法

一、材料

1.精漿和血清樣本：從北京人類精子庫(kù)捐精者中招募了31例健康志愿者，排除心、肝、腎等重要臟器疾病，近3個(gè)月無(wú)用藥史，年齡22～35周歲。精液常規(guī)分析按照《WHO人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》第五版［5］進(jìn)行分析。本項(xiàng)研究經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有提供精子樣本的志愿者簽署書面知情同意書。

2.主要試劑及儀器：采用北京百奧萊博科技有限公司的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒，其試驗(yàn)批內(nèi)誤差小于9%，批間誤差小于15%；BioTek ELx800酶標(biāo)儀（伯騰，美國(guó)）、BioTek ELx50洗板機(jī)（伯騰，美國(guó)）、Megafuge 1.0R 離心機(jī)（賀利，德國(guó)）、Thermo Fresco 21離心機(jī)（賀利，德國(guó)）等。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.精漿制備：按《WHO人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》第五版要求，所有志愿者均禁欲3～7d，手淫法留取精液于清潔無(wú)菌杯中。37℃水浴箱內(nèi)孵育30min，精液液化后做常規(guī)分析，主要包括精液量、精子濃度、精子活力等指標(biāo)。檢測(cè)后將精液置于Thermo Fresco 21離心機(jī)，以4℃ 1，000g離心10min。仔細(xì)收集精漿，分裝標(biāo)記后存放于－70℃冰箱待統(tǒng)一測(cè)定。

2.血清制備：按試劑盒說(shuō)明書留取標(biāo)本，標(biāo)本不可有溶血、乳濁、嚴(yán)重黃疸。采集空腹志愿者靜脈血于自凝管，血液在室溫自然凝固10～20min后，置于 Megafuge 1.0R 離心機(jī)，以2，500r／min離心20min。仔細(xì)收集上清，分裝標(biāo)記后存放于－70℃冰箱待統(tǒng)一測(cè)定。

3.精漿及血清Hey濃度的測(cè)定：將試劑盒和標(biāo)本平衡至室溫。參照使用說(shuō)明書，首先將標(biāo)準(zhǔn)品次遞稀釋后加樣，設(shè)空白孔，然后向待測(cè)樣品孔逐一加入待測(cè)樣品并稀釋，然后經(jīng)過(guò)溫育、配液、洗滌、加酶、再溫育、再洗滌、顯色、終止等步驟，最后用酶標(biāo)儀，以450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。應(yīng)用 Curve Expert 1.3軟件，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后根據(jù)樣品的OD值計(jì)算得出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)后，最終得出樣品的實(shí)際濃度。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

將所得數(shù)據(jù)采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行分析處理。先檢驗(yàn)精漿Hcy濃度、血清Hcy濃度及精液參數(shù)是否為正態(tài)分布。如果為正態(tài)分布則探討精漿Hcy的濃度范圍采用正態(tài)分布法；如果為非正態(tài)分布則探討精漿Hcy的濃度范圍選用百分位數(shù)法。采用Spearman相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、精漿Hcy濃度的參考值范圍

經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，精漿和血清Hcy濃度為偏態(tài)分布。采用SPSS 12.0分析得出精漿Hcy幾何平均值為11.02μmol／L，中位數(shù)10.59μmol／L，按百分位數(shù)法分析健康青年男性精漿Hcy濃度的參考值范圍為6.02～21.96μmol／L（95%CI）；血清 Hcy濃度幾何平均值為21.21μmol／L，中位數(shù)10.74μmol／L，參考范圍為7.3～236.45μmol／L（95%CI）（表1）。

表1 精漿及血清Hcy濃度的百分位點(diǎn)

二、精漿Hcy濃度、一次射精精漿Hcy總含量、血清Hcy濃度與精液參數(shù)之間的相關(guān)性分析

經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，血清Hcy濃度及精子活力為偏態(tài)分布，精子濃度、精液量及一次射精精漿中Hcy的總量近似正態(tài)分布。采用Spearman相關(guān)性分析結(jié)果如下（表2）。

表2 精漿Hcy濃度、一次射精精漿Hcy總含量及血清Hcy濃度與精液參數(shù)相關(guān)性

發(fā)現(xiàn)精漿Hcy濃度與精子活力存在顯著負(fù)相關(guān)（圖1），一次射精精漿Hcy總含量與精液量存在顯著正相關(guān)；其余各指標(biāo)之間無(wú)顯著相關(guān)性。

圖1 精漿Hcy濃度與精子活力相關(guān)性的散點(diǎn)圖

三、血清Hcy濃度和精漿Hcy濃度的相關(guān)分析

由于血清Hcy濃度和精漿Hcy濃度均為偏態(tài)，所以采用Spearman相關(guān)分析，兩者之間的相關(guān)性結(jié)果（r＝0.101，P＝0.589）顯示不存在顯著相關(guān)性。

討 論

Hcy是體內(nèi)三種含硫氨基酸之一，是甲硫氨酸循環(huán)和半胱氨酸代謝的重要中間產(chǎn)物，其本身并不參加蛋白質(zhì)的合成。Hcy在體內(nèi)主要代謝途徑有三條：（1）Hcy在蛋氨酸合成酶（MS）及輔酶維生素B12參與下，與5－甲基四氫葉酸合成蛋氨酸和四氫葉酸，而5－甲基四氫葉酸是在亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）催化下還原而來(lái)；（2）Hcy在胱硫醚－β－合成酶（CBS）及輔酶維生素B6參與下，與絲氨酸縮合成胱硫醚，胱硫醚進(jìn)一步斷裂成胱氨酸和α－酮丁酸；（3）Hcy在細(xì)胞內(nèi)形成后直接釋放到細(xì)胞外液。如果某些環(huán)節(jié)發(fā)生問(wèn)題就可能引起Hcy的堆積，會(huì)導(dǎo)致高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteinaemia），進(jìn)而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生一系列有害影響。

近些年國(guó)外一些研究發(fā)現(xiàn)，生育力低下的男性精漿中Hcy的濃度明顯高于正常男性，同時(shí)證實(shí)精液中Hcy水平升高可以損害胚胎的質(zhì)量并引起出生缺陷［6，7］。但是目前國(guó)內(nèi)關(guān)于Hcy與男性生育力方面的研究報(bào)道還甚少。本研究采用ELISA方法建立了健康青年男性精漿Hcy濃度參考值范圍6.02～21.96μmol／L（95%CI），中位數(shù)10.59μmol／L，為進(jìn)一步的深入研究提供了參考。但是，國(guó)外學(xué)者Boxmeer等［8］在研究中采用高效液相色譜法（HPLC）得出70例生育力正常男性精漿Hcy濃度中位數(shù)為4.7μmol／L（1.7～30.4μmol／L）。我們的檢測(cè)結(jié)果與國(guó)外數(shù)據(jù)比較存在明顯的差異。探求其原因可能與下列因素有關(guān)：（1）測(cè)定方法的不同及樣本量的差別可能為出現(xiàn)差異的原因之一；（2）兩者研究對(duì)象的種族、飲食結(jié)構(gòu)、生活方式、生活環(huán)境等也是重要的影響因素；（3）由于精漿中蛋白含量很高，粘度大，因此給測(cè)量過(guò)程中產(chǎn)生困難，產(chǎn)生誤差的概率增加。

本研究發(fā)現(xiàn)精漿Hcy濃度與精子活力存在顯著負(fù)相關(guān)，提示精子活力下降伴隨著精漿Hcy濃度的升高。因此推測(cè)，精漿Hcy濃度有可能成為反映精子活力的重要指標(biāo)。精漿Hcy濃度增高可能會(huì)對(duì)精子產(chǎn)生某種毒害作用，使精子活力降低。除此之外，本研究未發(fā)現(xiàn)精漿Hcy濃度與其他精液參數(shù)存在顯著相關(guān)性。Crha等［9］研究發(fā)現(xiàn)無(wú)精子癥患者精漿Hcy水平顯著低于正常人水平，由此可見，精漿中過(guò)高或過(guò)低的Hcy濃度都可能引起男性生育力降低。有證據(jù)表明，高濃度的Hcy有直接的細(xì)胞毒性，內(nèi)膜的損傷，氧化應(yīng)激物質(zhì)（ROS）的過(guò)度產(chǎn)生，轉(zhuǎn)甲基作用受到抑制，基因的異常表達(dá)［10］。但一些研究證明，少量的氧自由基對(duì)精子功能和精卵結(jié)合是必要的［11－13］。

本研究顯示，精漿Hcy濃度與血清Hcy濃度無(wú)相關(guān)性（r＝0.101，P＝0.589），而且血清 Hcy與精子活力未呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，由此推測(cè)可能是精漿中的Hcy直接與精子接觸發(fā)揮毒害作用。但是，Crha等［9］研究卻發(fā)現(xiàn)，正常人血清Hcy濃度與精漿Hcy濃度之間存在顯著正相關(guān)（r＝0.297，P＝0.019）。Boxmeer等［8，14］在兩次研究中，關(guān)于精漿與血清Hcy濃度相關(guān)性卻得出了相反的結(jié)論（r＝0.12，P＝0.41）和（r＝0.16，P＜0.05）。因此，要認(rèn)清兩者之間的相關(guān)性還有待進(jìn)一步深入研究。在下一步的研究中應(yīng)增加樣本的數(shù)量，減小誤差，同時(shí)更加注重血液中Hcy與精漿中Hcy相互轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究。本研究還顯示，血清Hcy濃度與精液參數(shù)無(wú)顯著相關(guān)性（P＞0.05），與Boxmeer等［14］研究結(jié)果一致。

目前，越來(lái)越多的證據(jù)表明Hcy對(duì)精子有影響。在生精細(xì)胞的增殖和分化發(fā)育過(guò)程中可以在不同的水平被干擾，從而影響到精子發(fā)生過(guò)程［15］。精子在成熟過(guò)程中細(xì)胞質(zhì)會(huì)逐漸減少，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的抗氧化酶體系含量有限并逐漸減少，這會(huì)使成熟過(guò)程中的精子對(duì)氧化自由基的損傷非常脆弱［16］。精液作為精子的微環(huán)境，精漿中包括很多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、酶和激素來(lái)保證精子正常代謝和精子功能，濃度過(guò)低或過(guò)高都會(huì)對(duì)精子功能產(chǎn)生影響。Hcy、葉酸和一碳單位代謝過(guò)程互相聯(lián)系，葉酸缺乏和Hcy的堆積會(huì)導(dǎo)致高同型半胱氨酸血癥。精漿Hcy增高引起炎癥因子增多，這些炎癥因子會(huì)引起精子參數(shù)下降和男性生育力降低。此外，精漿Hcy會(huì)使機(jī)體可利用的一氧化氮（NO）減低，NO代謝途徑會(huì)影響到陰莖勃起、血睪屏障功能、精子運(yùn)動(dòng)能力、精子獲能、頂體反應(yīng)和受精［17，18］。總之，高濃度的精漿Hcy可以在精子發(fā)生及成熟后的不同階段產(chǎn)生有害影響，進(jìn)而影響生育力。

體內(nèi)約90%的精漿來(lái)源于睪丸以外的附屬腺體組織，而且很可能與輸精管中的液體成分不同，且與在附睪中精子成熟的微環(huán)境亦不同。并且精漿的微環(huán)境與精子發(fā)生的微環(huán)境有著比較大的差別，所以檢測(cè)睪丸穿刺組織中的Hcy濃度對(duì)研究Hcy對(duì)精子發(fā)生及成熟的影響會(huì)更有意義。此外，精子內(nèi)Hcy濃度與精漿Hcy濃度、一次射精精漿Hcy的總含量、精液參數(shù)之間的關(guān)系也有待進(jìn)一步研究。這將會(huì)更加全面的揭示精漿Hcy濃度變化對(duì)男性生育力的影響。

［1］馮勝?gòu)?qiáng)，葉平，駱雷鳴，等 .北京市1680名社區(qū)居民血清同型半胱氨酸與代謝綜合征關(guān)系的橫斷面研究［J］.中華流行病學(xué)雜志，2012，33：256－259.

［2］Schalinske KL，Smazal AL.Homocysteine imbalance：a pathological metabolic marker［J］.Adv Nutr，2012，3：755－762.

［3］Ebisch IM，Thomas CM，Peters WH，et al.The importance of folate，zinc and antioxidants in the pathogenesis and prevention of subfertility［J］.Hum Reprod Update，2007，13：163－174.

［4］Forges T，Monnier－Barbarino P，Alberto JM，et al.Impact of folate and homocysteine metabolism on human reproductive health［J］.Hum Reprod Update，2007，13：225－238.

［5］WHO（谷翊群，陳振文，盧文紅，等譯）.世界衛(wèi)生組織人類精液檢測(cè)與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)［S］.第5版 .北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：5－40.

［6］Ebisch IM，Peters WH，Thomas CM，et al.Homocysteine，glutathione and related thiols affect fertility parameters in the（sub）fertile couple［J］.Hum Reprod，2006，21：1725－1733.

［7］Molloy AM，Brody LC，Mills JL，et al.The search for genetic polymorphisms in the homocysteine／folate pathway that contribute to the etiology of human neural tube defects［J］.Birth Defects Res A Clin Mol Teratol，2009，85：285－294.

［8］Boxmeer JC，Smith M，Elaine U，et al.Low folate in seminal plasma is associated with increased sperm DNA damage［J］.Fertil Steril，2009，92：548－556.

［9］Crha I，Kralikova M，Melounov J，et al.Seminal plasma homocysteine，folate and cobalamin in men with obstructive and non－obstructive azoospermia［J］.Assist Reprod Genet，2010，27：533－538.

［10］Boxmeer JC.The homocysteine pathway in human subfertility［M］.Rotterdam：Erasmus University Rotterdamp Publisher，2008：13.

［11］Lewis SE，Aitken RJ.DNA damage to spermatozoa has impacts on fertilization and pregnancy［J］.Cell Tissue Res，2005，322：33－41.

［12］Weiss N.Mechanisms of increased vascular oxidant stress in hyperhomocysteinemia and its impact on endothelial function［J］.Curr Drug Metab，2005，6：27－36.

［13］Agarwal A，Prabakaran S，Allamaneni S.What anandrologist／urologist should know about free radicals and why［J］.Urology，2006，67：2－8.

［14］Boxmeer JC，Smith M，Weber RF，et al.Seminal plasma cobalamin significantly correlates with sperm concentration in males undergoing IVF or ICSI procedures［J］.J Androl，2007，28：521－527.

［15］Tunc O，Tremellen K.Oxidative DNA damage impairs global sperm DNA methylation in infertile men［J］.J Assist Reprod Genet，2009，26：537－544.

［16］Aitken RJ，De Iuliis GN.Origins and consequences of DNA damage in male germ cells［J／OL］.Reprod Biomed Online，2007，14：727－733.

［17］Romerio SC， Linder L， Nyfeler J， et al.Acute hyperhomocysteinaemia decreases NO bioavailability in healthy adults［J］.Atherosclerosis，2004，176：337－344.

［18］Zhang X，Li H，Jin H，et al.Effects of homocysteine on endothelial nitric oxide production［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2000，279：671－678.