高美華 李園園 王麗娜 叢蓓蓓 王 冰 張 蓓 李 營 梁 潔

(青島大學醫(yī)學院免疫學教研室，青島 266071)

CD59相對分子量18～20 kD，其基因定位于人類第11號染色體短臂上，配體為CD2。廣泛表達于人外周血白細胞、紅細胞和其他多種細胞，缺乏胞內(nèi)段，通過棕櫚?；鶊F錨固于細胞膜。細胞活化后CD59分子被募集于細胞膜脂筏(Lipid rafts)區(qū)域。CD59抗體在共刺激信號存在下可誘導T淋巴細胞早期活化，引起后期胞內(nèi)信號分子的級聯(lián)反應(yīng)［1］。但CD59分子缺乏跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，無法直接向胞內(nèi)傳遞信號，其功能的發(fā)揮可能通過非特異性跨膜蛋白或接頭蛋白得以實現(xiàn)。LAT分子量為36～38 kD，主要表達于T細胞、NK細胞、肥大細胞和血小板。LAT分子是T細胞活化的重要接頭分子，經(jīng)棕櫚?；筮M入脂筏傳遞細胞活化信號［2］。LAT分子本身不含棕櫚酸基團，但在靠近細胞膜的胞內(nèi)區(qū)有2個棕櫚?；稽c(C26，C29)。本課題前期已證實CD59能使LAT分子進入脂筏［3］。本研究先構(gòu)建LAT-GFP融合蛋白，以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體轉(zhuǎn)染Jurkat細胞，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系Jurkat-GFP。將pSU-PER-siCD59干擾質(zhì)粒導入Jurkat-GFP細胞下調(diào)CD59表達，并利用CD59單克隆抗體刺激Jurkat-GFP細胞。重點研究下調(diào)CD59分子的表達及使用抗體活化CD59分子對細胞增殖及細胞信號轉(zhuǎn)導通路中信號分子活化水平的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料 LAT-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體由上海吉凱公司構(gòu)建。Jurkat細胞、pSUPER-siCD59干擾質(zhì)粒和大腸埃希菌JM109由本實驗室提供。兔抗人CD59單抗(mAb)購于Abcam。TRITC標記山羊抗兔IgG和辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔IgG購于北京康為。兔抗人LCK抗體購于Abgent。兔抗人ZAP70磷酸化單抗及兔抗人PLCr1抗體購于Abcam。兔抗人ZAP70抗體、兔抗人PLCr1磷酸化抗體和兔抗人LCK磷酸化抗體均購于上海生工。兔抗人beta-Actin單克隆抗體購于中杉金橋。電轉(zhuǎn)儀ECM830購于美國BTX公司。激光共聚焦顯微鏡OLYMPUS FLUOVIEW FV1000購于日本公司。

1.2 方法

1.2.1 Jurkat細胞系的培養(yǎng)與傳代 Jurkat細胞接種于含10%胎牛血清(ExCell)1%雙抗(105U/L青霉素、105U/L鏈霉素)RPMI1640培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)其細胞密度每2～3 d換液或傳代。

1.2.2 LAT-GFP穩(wěn)定表達細胞系的建立 LATGFP逆轉(zhuǎn)錄病毒由上海吉凱公司合成。按Lentiviral Vector Particle，收集處于對數(shù)生長期的正常Jurkat細胞，以5 000 cell/孔接種96孔板，按MOI值為100加入逆轉(zhuǎn)錄病毒。轉(zhuǎn)染后48 h(1 μg/ml)嘌呤霉素篩選，轉(zhuǎn)染后96 h觀察融合蛋白熒光表達。篩選后細胞擴大培養(yǎng)。

1.2.3 pSUPER-siCD59干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LAT-GFP細胞 pSUPER-siCD59干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌，挑取單克隆，液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)。按EndoFree Plasmid ezFlow Maxiprep Kit(BIOMIGA)，抽提質(zhì)粒。收集對數(shù)生長期LAT-GFP細胞，調(diào)節(jié)細胞濃度為4 ×106個/ml。取 250 μl細胞懸液與 50 μl質(zhì)粒加入4 mm電轉(zhuǎn)杯(BTX)，混勻，冰上孵育15 min，按300 V，10 ms電擊。電擊完成后將電轉(zhuǎn)杯置冰上孵育15 min，轉(zhuǎn)入含20%血清PBS離心管中離心，加入完全培養(yǎng)基重懸于24孔板，細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后24 h(4 mg/ml)G418篩選陽性細胞，48 h觀察熒光表達。

1.2.4 激光共聚焦顯微鏡檢測CD59抗體作用前后，LAT和CD59在各組細胞細胞膜上的分布 實驗分兩種處理。一組細胞固定后加CD59抗體，觀察相對靜止狀態(tài)下CD59與LAT的分布。方法為細胞離心后PBS洗滌，調(diào)整細胞密度滴于黏附載玻片，涂成單細胞層，晾干。4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS洗3次，每次5 min。10%山羊血清室溫封閉30 min，輕輕甩去封閉液，加入兔抗人CD59一抗。濕盒4℃過夜孵育后輕輕甩去一抗稀釋液，加入羅丹明標記二抗。室溫避光孵育2 h后PBS洗3次，每次5 min，70%甘油封閉，立即共聚焦激光顯微鏡觀察。另一組預(yù)先用CD59一抗刺激細胞再固定，觀察抗體活化后CD59和LAT分子的分布。方法為細胞離心后，基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸，加入兔抗人CD59一抗，室溫低速搖床2 h，PBS洗滌2次，每次5 min，加入羅丹明標記二抗，室溫低速搖床1 h，PBS洗3遍，每次5 min。涂于玻片上，室溫晾干，70%甘油封片，共聚焦激光顯微鏡觀察。

1.2.5 MTT檢測各組細胞增殖率 取對數(shù)生長期細胞，按1×105個/孔，接種于96孔板，每組設(shè)3個平行復孔。其中抗體活化組加入CD59抗體10 μg/孔，細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。加入MTT(5 mg/ml)10 μl/孔，37℃ 孵育 4 h，離心去上清，加入 DMSO 150 μl/孔，室溫低速振蕩10 min使結(jié)晶完全溶解。采用全自動酶標檢測儀于490 nm處測定各組吸光光度(A)值。

1.2.6 Western blot檢測CD59的表達水平及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導分子磷酸化水平 收集對數(shù)生長期各組細胞1×107個，提取總蛋白。SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫低速搖床封閉2 h，加入一抗4℃搖床過夜孵育。TBST漂洗3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標記二抗，室溫搖床孵育2 h。TBST洗3次，每次10 min。加入顯色液，室溫避光孵育5 min，曝光拍照。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析處理實驗數(shù)據(jù)，以表示。組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 熒光顯微鏡下熒光表達 逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染Jurkat細胞(MOI=100)，轉(zhuǎn)染后72 h出現(xiàn)熒光，熒光表達于細胞膜，轉(zhuǎn)染后96 h熒光表達最強，繼續(xù)培養(yǎng)熒光穩(wěn)定表達(圖1A);pSUPER-siCD59干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Jurkat-GFP細胞，轉(zhuǎn)染后24 h出現(xiàn)綠色熒光，熒光表達于胞漿和胞膜(圖1B)。

2.2 激光共聚焦顯微鏡下CD59抗體活化前后，LAT分子和CD59分子在細胞膜上的定位 細胞預(yù)先用多聚甲醛固定再加CD59抗體可視為自然狀態(tài)下CD59和LAT的分布，CD59分子紅色標記，LAT分子用綠色熒光標記。圖2A為靜止狀態(tài)下Jurkat-GFP細胞中CD59和LAT分子在細胞膜的分布，可見綠色熒光和紅色熒光在細胞膜上彌散存在，未見明顯點狀聚集;圖2B為轉(zhuǎn)染pSUPER-siCD59干擾質(zhì)粒的Jurkat-GFP細胞，可見細胞質(zhì)和細胞膜均表達綠色熒光，紅色熒光只表達于細胞膜但熒光強度較為轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組明顯變?nèi)?，說明CD59分子在干擾質(zhì)粒作用下表達量降低;圖2C中Jurkat-GFP細胞先加CD59抗體刺激后再固定，可用于觀察細胞經(jīng)CD59分子活化后CD59和LAT分子在細胞膜的定位。鏡下可見，綠色熒光與紅色熒光在細胞膜上呈點簇狀分布，局部區(qū)熒光疊加。

圖1 熒光顯微鏡下細胞熒光分布(×100)Fig.1 Distribution of fluorescence on transfected cells(×100)

2.3 MTT結(jié)果 與正常Jurkat-GFP細胞相比，轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒后Jurkat-GFP細胞增殖速率明顯降低(PAB＜0.05)，而CD59活化后Jurkat-GFP細胞增殖速率顯著增高(PAC＜0.05)，見圖3。

2.4 Western blot檢測各組細胞中細胞活化相關(guān)磷酸化蛋白水平的變化 PLCr1、ZAP70、LCK蛋白的總體表達水平在三組細胞中差異不明顯(P＞0.05)，但其磷酸化水平存在明顯差異。轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒組細胞蛋白的磷酸化水平低于空白對照組，抗體活化組細胞蛋白磷酸化水平最高，差異均有統(tǒng)計學意義(PAB＜0.05，PAC＜0.05，PBC＜0.05)，見圖4。

圖2 CD59分子與LAT分子在細胞膜的表達分布Fig.2 Expression and distribution of CD59 and LAT on different cells membrane

圖4 Western blot檢測各組細胞蛋白及其磷酸化水平Fig.4 Total/phoshorylation protein levels of different groups by Western blot

圖3 不同處理組CD59分子對細胞增殖的影響Fig.3 Proliferation of three cell groups

3 討論

CD59分子即糖基磷脂酰肌醇錨固蛋白，是Ly-6超家族成員之一。作為細胞免遭補體溶解的重要的同源限制因子，通常認為CD59分子通過阻斷C9與C5-8復合體的結(jié)合而抑制膜攻擊復合物(Membrane attact complex，MAC)的形成，從而保護細胞不被裂解［4，5］。此外，CD59 分子在信號轉(zhuǎn)導中也發(fā)揮重要作用，研究表明CD59抗體交聯(lián)后可以募集ZAP70、Lyn和SFKs等進入脂筏，刺激IL-2的分泌和Ca2+的釋放［6-9］。LAT分子可分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)三部分，其胞漿區(qū)含有10個絡(luò)氨酸殘基，5個絡(luò)氨酸與Grb2的SH2結(jié)合，5個絡(luò)氨酸與PLCr的SH2結(jié)合。LAT分子可被SYK家族激酶中的ZAP70磷酸化，并與Grb2、Gads和PLCr1結(jié)合，從而啟動信號轉(zhuǎn)導過程中的Ca2+內(nèi)流和Ras絲裂原活化的蛋白激酶途徑(Ras-MAPK)［10，11］。

我們針對CD59和LAT分子的功能和結(jié)構(gòu)特點，對其在信號轉(zhuǎn)導中的相關(guān)性進行研究。該實驗以攜帶有LAT-GFP融合蛋白的逆轉(zhuǎn)錄病毒為工具并利用CD59熒光標記抗體，實現(xiàn)對兩個分子的可視化研究。免疫熒光顯示，CD59抗體刺激Jurkat-GFP細胞后，細胞膜上LAT分子由彌散分布轉(zhuǎn)為點簇狀聚集并與CD59分子共同定位于脂筏區(qū)域，這與先前的研究結(jié)果是一致的［3，4］，據(jù)此我們推測，活化后CD59分子對LAT分子募集入脂筏具有促進作用。MTT結(jié)果表明，抗體活化組細胞的增殖水平明顯高于空白對照組，而質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞增殖速率最慢(P＜0.05)，提示CD59分子抗體刺激后可能引起Jurkat細胞的活化。此外研究表明，T淋巴細胞活化后LAT分子可能作用于胞內(nèi)的Grb2、PLCr1、Cbl等下游信號分子，介導 T淋巴細胞胞內(nèi)信號的傳導［12］，因而我們利用Western blot對其活化信號通路的下游分子進行檢測，結(jié)果顯示:與空白對照組相比，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和抗體活化組 ZAP-70、PLCr-1和LCK總蛋白表達無明顯差異(P＜0.05)，但磷酸化蛋白表達有顯著差異(P＜0.05)，其中抗體活化組蛋白磷酸化水平最高，空白對照組次之，CD59干擾組的蛋白磷酸化水平最低。

Lin等人［13］的研究發(fā)現(xiàn)LAT分子的胞外區(qū)和穿膜區(qū)不是LAT分子進入脂筏介導一系列胞內(nèi)效應(yīng)的唯一結(jié)構(gòu)。進一步地研究證實，LAT分子其結(jié)構(gòu)在胞內(nèi)區(qū)近細胞膜的位置有兩個半胱氨酸保守區(qū)(C26，C29)，作為其棕櫚酰化位點，該位點突變后LAT分子無法被棕櫚?；?，進而不能被募集入脂筏。因此，我們猜想CD59分子可能提供了活化LAT分子的棕櫚酸基團，從而誘導T淋巴細胞的活化作用。其機制可能與分子間棕櫚酸基團的轉(zhuǎn)移有關(guān):CD59分子由103位氨基酸組成，其N端含單一的糖基化位點，而C端通過棕櫚酸基團與細胞錨連。由于其缺乏胞內(nèi)段，故不能向細胞內(nèi)直接傳遞信號，必須通過一個接頭分子才可將活化信號傳至胞內(nèi)。LAT分子是T細胞活化的接頭信號分子，可把胞外活化信號傳導至胞內(nèi)，活化Ras信號轉(zhuǎn)導途徑，最終引起胞內(nèi)Ca2+的釋放，誘導細胞內(nèi)NF-AT的轉(zhuǎn)錄。

綜上所述，CD59抗體活化后，CD59和LAT分子可產(chǎn)生明顯聚集現(xiàn)象并共定位于胞膜，還可以引起信號轉(zhuǎn)導通路的下游磷酸化蛋白表達增高，從而更進一步地證實活化CD59分子可能促進LAT介導的T細胞信號轉(zhuǎn)導。更為重要的是，對CD59分子在細胞信號通路中的研究可為推測其他GPI-APs與細胞信號轉(zhuǎn)導通路的相關(guān)性研究提供有力依據(jù)，并為CD59分子在腫瘤機制研究中奠定了堅實的基礎(chǔ)，這對于今后腫瘤疾病的靶向治療具有重要的意義。

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