仉 潔 郝京生 李俊甫 邢龍龍 劉志文 鐘 理 劉 薇

(河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，保定 071002)

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Tregs)是近年來逐漸被人們認(rèn)識的一類新型的具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群，其可以分為天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(natural Tregs，nTregs)和誘導(dǎo)產(chǎn)生的適應(yīng)性調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞(inducible Tregs，iTregs)，nTregs在胸腺中發(fā)育，在維持機(jī)體免疫耐受、移植免疫和腫瘤免疫逃逸等方面發(fā)揮著重要作用［1］;iTregs是由CD4+T細(xì)胞在某些特定生理?xiàng)l件下在外周誘導(dǎo)分化而來。Tregs可通過細(xì)胞間的直接接觸和分泌大量IL-10、TGF-β等機(jī)制抑制多種免疫細(xì)胞，如B細(xì)胞、NK細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、DC細(xì)胞和 CIK細(xì)胞。Tregs表面主要的特異性標(biāo)記有CD4、CD25、Foxp3等，其中Foxp3在Tregs發(fā)生及功能維持中起著重要的作用，被認(rèn)為是Tregs的主要調(diào)控基因，可作為nTregs的特異性鑒定和功能特異性標(biāo)志。nTregs主要分布于人體的胸腺、外周血、淋巴器官及臍靜脈血中，在小鼠和健康人體中約占外周 CD4+T細(xì)胞5%～10%［2］，新生兒、幼兒與成人外周血中 nTregs含量無明顯差異，但臍血來源廣泛。由于Tregs在體內(nèi)含量低，體外的培養(yǎng)擴(kuò)增又面臨很大的困難，造成Tregs的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于臨床用量，因此限制了其在臨床治療上的應(yīng)用。近來研究證實(shí)聯(lián)合應(yīng)用CD3/CD28單抗和高濃度的IL-2可提高CD25及Foxp3在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，并且IL-2能在體外誘導(dǎo)CD4+CD25－T 細(xì)胞轉(zhuǎn)化為 CD4+CD25+Tregs［3］，IL-7可維持CD4表達(dá)［4］，因此本研究旨在初步探討IL-7聯(lián)合IL-2對新生兒臍血CD4+CD25－T細(xì)胞誘導(dǎo)成為CD4+CD25+Tregs增殖的影響，以滿足臨床對CD4+CD25+Tregs數(shù)量的需求。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 CD4+CD25+Tregs磁分選試劑盒、抗人CD3/CD28單克隆抗體(mAbCD3/CD28)購自德國MACS公司;改良型RPMI1640培養(yǎng)基購自美國 HyClone公司;胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Excell公司;重組人白細(xì)胞介素7(rh IL-7)購自美國PeproTech公司;重組人白細(xì)胞介素2(rh IL-2)購自北京四環(huán)生物制藥有限公司;CD4-PE、CD25-FITC、Foxp3-APC 購自 eBioscience公司;MTS試劑購自美國Promega公司;DMSO購自美國Sigma公司;Ficoll淋巴細(xì)胞分離液(1.077±0.002)g/ml購自天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司;一次性培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板等耗材購自德國Corning公司。

1.2 標(biāo)本 新生兒臍血采自婦產(chǎn)科足月健康新生兒，胎兒娩出后立即從胎盤臍靜脈穿刺采血放入含有28ml保存液的采血袋中。外周血取自健康志愿者。所有血液樣本均在采樣后4 h內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。

1.3 CD4+CD25－T細(xì)胞分選、鑒定及純化 采用常規(guī)的密度梯度離心法分離臍血及成人外周血單個(gè)核細(xì)胞，用生理鹽水洗滌細(xì)胞3遍，放入培養(yǎng)瓶中，37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2，完全飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育過夜，去除黏附細(xì)胞后，調(diào)整細(xì)胞濃度進(jìn)行MACS免疫磁珠分選，CD8、CD19、CD123和CD127雞尾酒抗體陰性分選得到CD4+T細(xì)胞，結(jié)合CD25抗體的磁珠陽性分選出CD4+CD25+T細(xì)胞和陰性分選出CD4+CD25－T細(xì)胞。CD4-PE和CD25-FITC染色劑對CD4+CD25－T細(xì)胞染色，流式細(xì)胞儀檢測所得該細(xì)胞純度。

1.4 體外添加不同濃度細(xì)胞因子IL-7誘導(dǎo)CD4+CD25－T細(xì)胞的增殖 將上述分離出的 CD4+CD25－T細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個(gè)/ml，加入24孔培養(yǎng)板中，依據(jù)加入細(xì)胞因子IL-7濃度的不同分為4組，即 A1組(2 ng/ml)，A2組(4 ng/ml)，A3組(6 ng/ml)，陰性對照組(0 ng/ml)，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，于培養(yǎng)第1天和第3天同時(shí)加入IL-7和mAb-CD3/CD28(2 μg/ml)。各組細(xì)胞每隔兩天半量換液，同時(shí)只補(bǔ)充細(xì)胞因子IL-2(2 000 U/ml)，37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2，完全飽和濕度進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)第3周用流式細(xì)胞術(shù)檢測擴(kuò)增后各組細(xì)胞CD4及CD25的表型變化。

1.5 CD4+CD25+T細(xì)胞體外培養(yǎng)條件 調(diào)整CD4+CD25+T細(xì)胞濃度至1×106個(gè)/ml，用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)第1天加入IL-2(2 000 U/ml)，同時(shí)加入mAbCD3/CD28(2 μg/ml)，37℃，體積分?jǐn)?shù) 5%CO2，完全飽和濕度進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)第3周用流式細(xì)胞術(shù)檢測擴(kuò)增后CD4+CD25+T細(xì)胞CD4及CD25的表型變化。

1.6 細(xì)胞活力及細(xì)胞計(jì)數(shù)的測定 將細(xì)胞樣本與0.2%的臺盼藍(lán)按照1∶1比例混勻染色后，靜置3～4 min。用Countstar細(xì)胞計(jì)數(shù)儀分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，死細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活率。細(xì)胞活率=(染色陰性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.7 誘導(dǎo)生成的CD4+CD25+T細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)

MTS法檢測體外誘導(dǎo)擴(kuò)增的iTregs及擴(kuò)增后的nTregs對成人外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)的增殖抑制作用。細(xì)胞培養(yǎng)第21天，用結(jié)合CD25抗體的磁珠從IL-7組陽性分選出誘導(dǎo)生成的CD4+CD25+Tregs，PBMCs與CD4+CD25+Tregs細(xì)胞數(shù)的比例分別為 2∶1、1∶1，PBMCs的起始細(xì)胞數(shù)為8×104個(gè)，Tregs的起始細(xì)胞數(shù)分別為4×104個(gè)、8×104個(gè)，混合培養(yǎng)于96孔板中，加入 mAbCD3(2 μg/ml)及 IL-2(1 000 U/ml)刺激共培養(yǎng)5 d。培養(yǎng)終止前4 h，每孔加入20 μl MTS試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶聯(lián)免疫分析儀上檢測波長為 492 nm 的光密度(OD)值［5］。抑制PBMC的增殖(%)=［(未含有Tregs的孔中被刺激的PBMC細(xì)胞的吸光率－加入Tregs后的被刺激的PBMC細(xì)胞的吸光率)/未含有Tregs的孔中被刺激的PBMC細(xì)胞的吸光率］×100%。

1.8 Real-time PCR檢測體外擴(kuò)增的各組細(xì)胞內(nèi)因子表達(dá) Trizol法分別提取純化nTregs及iTregs總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。Real-time PCR根據(jù)試劑盒說明書將1 μl cDNA置于10 μl含有PCR引物的反應(yīng)體系中，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性 30 s，隨后 95℃ 3 s，60℃ 30 s，共 40 個(gè)循環(huán)。引物序列如表1所示。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 相對Real-Time PCR結(jié)果的分析方法為2－△△Ct法，用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以表示。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD4+CD25+Treg細(xì)胞的純度和活性 免疫磁珠分選出的CD4+CD25－T細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，CD4+CD25－T 細(xì)胞占 95.08% ±0.87%(n=3，下同，P＜0.01)(圖1A)，表明起始時(shí)主要是 CD4+CD25－T細(xì)胞。免疫磁珠分選出的CD4+CD25+T細(xì)胞占94.43% ±0.40%(P＜0.01)(圖1B)。細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測免疫磁珠分選后CD4+CD25－T細(xì)胞的活率為90.39% ±8.52%(P＜0.05)，CD4+CD25+T細(xì)胞活率為92.67% ±5.56%(P＜0.05)。

2.2 體外擴(kuò)增nTregs和iTregs后的流式檢測結(jié)果

經(jīng)過3周的體外培養(yǎng)，各組細(xì)胞均有較明顯的增殖(如圖2所示)，鏡下觀察可見細(xì)胞飽滿透亮，聚集成團(tuán)，呈現(xiàn)集落樣生長，隨培養(yǎng)時(shí)間的增長，集落數(shù)增多，組成集落的細(xì)胞數(shù)亦增多，細(xì)胞呈現(xiàn)堆積樣(如圖3所示)。免疫磁珠分選后nTregs的擴(kuò)增倍數(shù)為(30±6)倍，細(xì)胞純度隨擴(kuò)增倍數(shù)的增加而下降，由培養(yǎng)前的94.43% ±0.40%下降到83.17% ±4.35%(P＜0.05)。CD4+CD25－T細(xì)胞培養(yǎng)前CD4+CD25+T細(xì)胞的比例為0.36% ±0.55%，IL-7試驗(yàn)組的平均擴(kuò)增倍數(shù)為(105±3)倍，各組間無顯著性差異(P＞0.05)，加入不同濃度IL-7培養(yǎng)后反應(yīng)體系中的CD4+CD25+T細(xì)胞比例明顯上調(diào)，即不同試驗(yàn)組A1組(2 ng/ml)為59.93% ±1.45%，A2組(4 ng/ml)為80.21% ±1.65%，A3組(6 ng/ml)為 71.70% ±1.21%;陰性對照組(0 ng/ml)擴(kuò)增倍數(shù)為(90±4)倍，CD4+CD25+T細(xì)胞比例為59.31% ±6.32%，(如圖4所示)，各組間有顯著性差異(P＜0.05)。

表1 各基因引物序列及產(chǎn)物片段大小Tab.1 Primer sequence and product size for each gene

圖1 細(xì)胞免疫磁珠分選后的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果Fig.1 Percentage of Tregs after purification with MACS beads

圖2 各組細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)的比較Fig.2 Comparison of amplification multiples between each group

圖3 培養(yǎng)過程中的細(xì)胞形態(tài)變化(×100)Fig.3 Changes of cells morphology in process of culture(×100)

圖4 各組細(xì)胞擴(kuò)增后的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果Fig.4 FACS results of every groups after amplification in vitro

2.3 體外擴(kuò)增后的CD4+CD25+T細(xì)胞對PBMCs增殖的抑制試驗(yàn) 為進(jìn)一步了解擴(kuò)增后CD4+CD25+Tregs的免疫抑制功能，我們通過MTS法鑒定擴(kuò)增后CD4+CD25+Tregs對PBMCs的增殖是否存在抑制作用，結(jié)果顯示有明顯的抑制作用，并且抑制率呈濃度依賴性(如圖5所示)，說明體外擴(kuò)增的CD4+CD25+Tregs具有免疫抑制功能(P＜0.05)(如圖6、7所示)。

2.4 RT-PCR檢測 Foxp3、IL-10和 TGF-β的 mRNA表達(dá) 在體內(nèi)，IL-10和TGF-β屬于可溶性抑制因子，是Tregs產(chǎn)生抑制效應(yīng)的活性分子，可直接或間接參與Tregs的活化及抑制性作用。Tregs控制炎癥和自身平衡擴(kuò)增的體內(nèi)模型上顯示出IL-10的抑制功能，Powrie等［7］在大腸炎小鼠模型上，證實(shí)IL-10是Tregs對抗原刺激后的T細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用的關(guān)鍵分子，但不能抑制初始T細(xì)胞。結(jié)果顯示IL-7誘導(dǎo)組和陰性對照組較nTregs可產(chǎn)生較多的抑制性細(xì)胞因子:IL-10、TGF-β，但降低了轉(zhuǎn)錄因子 Foxp3的表達(dá)(如圖8所示)。

圖5 擴(kuò)增后的CD4+CD25+Tregs對異體PBMCs增殖的抑制率與濃度之間的關(guān)系Fig.5 Relationship between inhibitory rates of CD4+CD25+T cells on allo PBMCs

圖6 擴(kuò)增后的CD4+CD25+Tregs對PBMCs增殖的影響Fig.6 Inhibitory effect of CD4+CD25+Tregs on proliferation of PBMCs

圖7 擴(kuò)增后的CD4+CD25+Tregs對PBMCs的增殖抑制Fig.7 Inhibitory effect of CD4+CD25+Tregs on proli-feration of PBMCs

圖8 Foxp3、IL-10和TGF-β的mRNA在Tregs中的表達(dá)Fig.8 Foxp3，IL-10 and TGF-β mRNA in Tregs

3 討論

Tregs在針對自身抗原和外來抗原的免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵調(diào)控作用，其缺乏或功能性的缺陷將導(dǎo)致多重病理性的失調(diào)，多項(xiàng)研究證實(shí)，在不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種疾病患者體內(nèi)，Tregs數(shù)量顯著低于正常水平［8，9］。Tregs可通過產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子如IL-10、TGF-β等調(diào)節(jié)Tregs與Th17細(xì)胞的平衡來控制自身反應(yīng)性或直接對效應(yīng)T細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用［10］。因此，將Tregs應(yīng)用于移植免疫和免疫耐受的誘導(dǎo)中，有望降低免疫排斥反應(yīng)。但由于在體外nTregs增殖較慢，細(xì)胞活性較低且對常用抗原的無反應(yīng)性，使Tregs的體外擴(kuò)增成為免疫學(xué)的一大難題，這就限制了其在臨床治療領(lǐng)域的應(yīng)用。近年研究表明，在體外可用CD4+CD25－T細(xì)胞為前體細(xì)胞，通過各種細(xì)胞因子的刺激，CD4+CD25－T 細(xì)胞可以轉(zhuǎn)化為 Tregs［10］。

IL-7是一種多效細(xì)胞因子，對維持CD4+T細(xì)胞的動(dòng)態(tài)增殖起重要作用，可以延長CD4+T細(xì)胞的存活［4］。有證據(jù)表明，IL-7可以抑制由IL-2引起的激活誘導(dǎo)死亡效應(yīng)［12］。IL-2在CD25及Foxp3持續(xù)高表達(dá)中發(fā)揮重要作用［13］。國內(nèi)外已有研究證實(shí)給患者回輸臍血來源的nTregs療效明顯，且無毒副作用、安全性及耐受性良好［14］。在本試驗(yàn)研究中，我們同時(shí)采用 IL-7、IL-2和 mAbCD3/CD28對臍血CD4+CD25－T細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，結(jié)果顯示，CD4+CD25－T細(xì)胞可被誘導(dǎo)成為具有較強(qiáng)免疫抑制功能的成熟iTregs，2～3周后可見細(xì)胞因子IL-7誘導(dǎo)產(chǎn)生的iTregs擴(kuò)增倍數(shù)明顯高于nTregs的擴(kuò)增(P＜0.05)，而且iTregs保持了nTregs的主要表型，更重要的是應(yīng)用IL-7、IL-2和mAbCD3/CD28誘導(dǎo)產(chǎn)生的iTregs與nTregs有著相似的抑制功能。IL-7可以提高CD4及CD25細(xì)胞表型表達(dá)，大大提高擴(kuò)增倍數(shù)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［15］，iTregs較 nTregs可產(chǎn)生較多的抑制性細(xì)胞因子如:IL-10、TGF-β。為建立移植免疫耐受、自身免疫疾病的治療等提供一條新的途徑，由于本試驗(yàn)中樣本數(shù)量有限，國內(nèi)外的參考數(shù)據(jù)不足，所以不排除個(gè)體差異造成的結(jié)果上的偏倚，仍需大量的研究對本試驗(yàn)的結(jié)論進(jìn)行驗(yàn)證，并且克服體外擴(kuò)增 iTregs的缺陷，繼續(xù)加深 IL-7對iTregs產(chǎn)生機(jī)制的認(rèn)識。

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