汪 偉 李冬梅 馬洪喜(長春大學(xué)特殊教育學(xué)院，長春 130022)

腦血管病是臨床常見病、多發(fā)病，其發(fā)病率、病死率逐年升高，在這一疾病相應(yīng)的治療過程中發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注(Cerebral ischemia-reperfusion，I/R)的病理生理過程起著重要的作用［1］。近年來研究發(fā)現(xiàn)腦I/R損傷與細(xì)胞凋亡有著密切的關(guān)系，凋亡機制參與腦I/R損傷已成為臨床研究的熱點［2］。以往研究表明，冠心舒通具有調(diào)整、改善心血管功能的作用，它能減輕心肌缺血程度及減小梗塞面積、能降低血漿纖維蛋白原含量、抑制血小板黏附性和聚集性、改善血液流變性、增加冠脈血流量及改善心肌的供血供氧，對心肌缺血再灌注損傷有明確的保護作用［3-5］，但對冠心舒通能否影響腦I/R損傷的研究甚少，本實驗通過檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及細(xì)胞凋亡的調(diào)控，旨在探究冠心舒通是否對腦I/R損傷具有保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 冠心舒通膠囊(咸陽步長制藥有限公司生產(chǎn)，每粒裝0.3 g，國藥準(zhǔn)字Z20020055，產(chǎn)品批號100101);兔抗鼠Bcl-2和Bax抗體購于北京博奧森生物有限公司;SP和DAB試劑盒購于福州邁新生物有限公司;ELISA試劑盒購于南京建成生物有限公司。

1.2 模型的制作 采用線栓法，結(jié)扎大鼠左側(cè)頸總動脈建立腦I/R模型。選長約5 cm、直徑0.24 mm的美國進口尼龍實驗栓線。用10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，麻醉滿意后四肢及頭部固定，頸部正中做2 cm豎切口，先分離左側(cè)頸總動脈，再分離左頸內(nèi)動脈及頸外動脈，避免刺激迷走神經(jīng)，沿頸內(nèi)動脈向上走行分離翼腭動脈，結(jié)扎根部。假手術(shù)組僅暴露頸總動脈其他不作處理。造模成功標(biāo)準(zhǔn)清醒后評定:(1)右側(cè)前肢屈曲，不能完全伸展;(2)提尾時，右側(cè)前肢抓力減弱;(3)提尾時向右側(cè)轉(zhuǎn)圈;(4)自由運動時，無方向性，向右側(cè)轉(zhuǎn)圈或傾倒;(5)不能自發(fā)行走，意識喪失。造模成功后2 h將栓線拔出形成再灌注模型。

1.3 動物分組及給藥 健康的Wistar大鼠60只(吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部動物實驗中心提供，動物許可證號:SCXK2007-吉大-0003)。體重(210±20)g，每組15只，隨機分為假手術(shù)組、腦I/R模型組、冠心舒通組;冠心舒通組依據(jù)大鼠長期毒性試驗分為:高劑量(1 g/kg)組和低劑量(0.5 g/kg)組，冠心舒通將其研磨制成懸濁液。造模前每組分別每日灌胃給予生理鹽水、生理鹽水、冠心舒通高劑量和冠心舒通低劑量，連續(xù)7 d;缺血120 min后松扎，傷口撒頭孢唑啉鈉粉末0.25 g后逐層縫合，放回籠中飼養(yǎng);假手術(shù)組僅分離頸總動脈，不做任何處理;術(shù)后每天上午灌胃給予生理鹽水、生理鹽水、冠心舒通高劑量和冠心舒通低劑量，3 d后水迷宮訓(xùn)練同時繼續(xù)給藥，連續(xù)7 d。

1.4 動物檢測選取 實驗結(jié)束后，去除死亡的和狀態(tài)極差的大鼠，每組各取10只檢測。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 Morris水迷宮測試 測試潛伏期、經(jīng)過平臺次數(shù)和平臺象限停留時間，Morris水迷宮訓(xùn)練7 d后，于第8天測試。

1.5.2 大鼠血清中Bcl-2和Bax蛋白水平的檢測采用ELISA法檢測，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

1.5.3 大鼠腦組織的病理改變 采用HE染色觀察，常規(guī)石蠟包埋，切片5 μm，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.5.4 大鼠腦組織中Bcl-2和Bax蛋白水平的檢測

采用免疫組織化學(xué)-SP法檢測，切片3 μm，嚴(yán)格按試劑盒說明書進行。光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果:細(xì)胞質(zhì)陽性呈棕黃色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核呈藍色。

1.5.5 大鼠腦組織中Bcl-2和Bax mRNA水平的檢測 引物序列由上海生物工程公司合成。Bcl-2;上游引物5'-CACATCTGGAGACTATAAGA-3'，下游引物5'-CTCTAAGTTGCGTTATCTAC-3'，產(chǎn)物242 bp;Bax:上游引物5'-GCTAATGGAGGAGAAGAAGT-3'，下游引物 5'-CTGACCTGTTGGACCTTGTG-3'，產(chǎn)物298 bp;凝膠成像后用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)分析軟件，測試潛伏期、經(jīng)過平臺次數(shù)、平臺象限停留時間、大鼠血清中Bcl-2及Bax的蛋白水平和腦組織中Bcl-2、Bax的蛋白及mRNA水平，其數(shù)據(jù)均以表示，進行t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 測試潛伏期、經(jīng)過平臺次數(shù)和平臺象限停留時間的檢測 與腦I/R模型組比較，冠心舒通高劑量和低劑量組大鼠測試潛伏期均縮短、經(jīng)過平臺次數(shù)均增多、平臺象限停留時間均增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，且冠心舒通高劑量組好于冠心舒通低劑量組，有顯著差異(P＜0.01);與假手術(shù)組比較，冠心舒通高劑量組大鼠測試潛伏期略延長、經(jīng)過平臺次數(shù)和平臺象限停留時間略減少，但無顯著差異(P＞0.05)，冠心舒通低劑量組大鼠測試潛伏期延長、經(jīng)過平臺次數(shù)和平臺象限停留時間減少，有顯著差異(P＜0.01)，腦I/R模型組大鼠測試潛伏期明顯延長、經(jīng)過平臺次數(shù)和平臺象限停留時間明顯減少，有顯著差異(P＜0.01);見表1。

表1 各組大鼠測試潛伏期、經(jīng)過平臺次數(shù)和平臺象限停留時間的比較(，n=15)Tab.1 Comparision of escape latency ，times to cross target area and average time spent in platform quadrant in different groups(，n=15)

表1 各組大鼠測試潛伏期、經(jīng)過平臺次數(shù)和平臺象限停留時間的比較(，n=15)Tab.1 Comparision of escape latency ，times to cross target area and average time spent in platform quadrant in different groups(，n=15)

Note:1)P＜0.01 compared with sham-operated group;2)P＜0.01 compared with model group;3)P＜0.01 compared with high-dose group.

Groups Escape latency(s) Times to cross target area Average time spent in platform quadrant(s)Sham-operated group 31.47±3.61 2.76±0.38 21.45±3.16 Model group 56.39±4.031) 0.93±0.121) 8.14±1.011)High-dose group 36.42±2.962) 2.61±0.332) 20.66±3.522)Low-dose group 43.18±3.273) 1.82±0.573) 15.26±1.933)

2.2 腦組織的病理改變結(jié)果 HE染色結(jié)果 假手術(shù)組:腦組織細(xì)胞排列緊密整齊;模型組:腦組織細(xì)胞排列松散紊亂，細(xì)胞核濃縮，細(xì)胞質(zhì)淡染;高劑量組:腦組織細(xì)胞排列比較緊密整齊;低劑量組:腦組織細(xì)胞排列較為緊密整齊，可見細(xì)胞核濃縮，細(xì)胞質(zhì)淡染;見圖1。

圖1 腦組織的病理改變(HE染色，×200)Fig.1 Pathological changes in brain tissue(HE staining ，×200)

2.3 大鼠血清中Bcl-2和Bax蛋白的水平 與腦I/R模型組比較，冠心舒通高劑量和低劑量組血清中Bax蛋白含量降低、Bcl-2蛋白含量升高均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，且冠心舒通高劑量組好于冠心舒通低劑量組，有顯著差異(P＜0.01);與假手術(shù)組比較，冠心舒通高劑量組大鼠血清中Bax蛋白含量略升高、Bcl-2蛋白含量略降低，但無顯著差異(P＞0.05)，冠心舒通低劑量組大鼠血清中Bax蛋白含量升高、Bcl-2蛋白含量降低，有顯著差異(P＜0.01)，腦I/R模型組大鼠血清中Bax蛋白含量明顯升高、Bcl-2蛋白含量明顯降低，有顯著差異(P＜0.01);見表2。

2.4 大鼠腦組織中Bcl-2和Bax蛋白表達的水平 與腦I/R模型組比較，冠心舒通高劑量和低劑量組大鼠腦組織中Bax蛋白含量降低、Bcl-2蛋白含量升高均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，且冠心舒通高劑量組好于冠心舒通低劑量組有顯著差異(P＜0.01);與假手術(shù)組比較，冠心舒通高劑量組大鼠腦組織中Bax蛋白含量略升高、Bcl-2蛋白含量略降低但無顯著差異(P＞0.05)，冠心舒通低劑量組大鼠腦組織中Bax蛋白含量升高、Bcl-2蛋白含量降低有顯著差異(P＜0.01)，腦I/R大鼠腦組織中Bax蛋白含量明顯升高、Bcl-2蛋白含量明顯降低有顯著差異(P＜0.01);采用Motic Images Advanced 3.2圖像分析系統(tǒng)，灰度值越高陽性表達越低，灰度值越低陽性表達越高。見表2，圖2～4。

2.5 大鼠腦組織中Bcl-2和Bax mRNA的水平 凝膠成像后用凝膠圖像分析儀分析結(jié)果，與腦I/R模型組比較，冠心舒通高劑量和低劑量組大鼠腦組織中Bax mRNA水平降低、Bcl-2 mRNA水平升高均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，且冠心舒通高劑量組好于冠心舒通低劑量組有顯著差異(P＜0.01);與假手術(shù)組比較，冠心舒通高劑量組大鼠腦組織中Bax mRNA水平略升高、Bcl-2 mRNA水平略降低但無顯著差異(P＞0.05)，冠心舒通低劑量組大鼠腦組織中 Bax mRNA水平升高、Bcl-2 mRNA水平降低，有顯著差異(P＜0.01)，腦 I/R模型組大鼠腦組織中 Bax mRNA水平明顯升高、Bcl-2 mRNA水平明顯降低有顯著差異(P＜0.01)。見表3。

表2 各組大鼠血清、腦組織中Bcl-2和Bax蛋白的比較(，n=15)Tab.2 Comparision of Bcl-2 and Bax protein expression in rat serum and brain tissues(，n=15)

表2 各組大鼠血清、腦組織中Bcl-2和Bax蛋白的比較(，n=15)Tab.2 Comparision of Bcl-2 and Bax protein expression in rat serum and brain tissues(，n=15)

Note:1)P＜0.01 compared with sham-operated group;2)P＜0.01 compared with model group;3)P＜0.01 compared with high-dose group.

Groups Serum(pg/ml)Brain tissue(gray value)Bcl-2 Bax Sham-operated group 7.45±1.03 5.27±1.14 100 Bcl-2 Bax.21±3.56 132.82±3.49 Model group 2.61±0.521) 10.16±1.351) 160.58±4.131) 82.12±2.061)High-dose group 7.09±1.122) 5.61±0.982) 110.65±2.712) 126.31±2.922)Low-dose group 5.03±0.763) 8.11±0.973) 136.72±3.463) 100.49±2.683)

圖2 腦組織中Bcl-2的表達(免疫組織化學(xué)染色 ，×200)Fig.2 Bcl-2 expression in brain tissue(Immunohistochemical staining ，×200)

圖3 腦組織中Bax的表達(免疫組織化學(xué)染色 ，×200)Fig.3 Bax expression in brain tissue(Immunohistochemical staining ，×200)

圖4 腦組織中Bcl-2和Bax蛋白的水平Fig.4 Protein levels of Bcl-2 and Bax in brain tissue

3 討論

近年來隨著腦血管病發(fā)病率的逐年上升，腦血管病成為臨床常見的三大致死疾病之一［6］，腦血管病尤其是缺血后再灌注損傷對腦的影響成為國內(nèi)學(xué)者研究缺血性腦損傷的熱點。眾多的研究［7］表明腦缺血再灌注損傷過程中細(xì)胞凋亡發(fā)揮重要作用，機體的細(xì)胞凋亡過程中有多種蛋白參與調(diào)控，其中Bcl-2蛋白家族是人們研究最多的一類凋亡蛋白［8］，Bcl-2蛋白家族分布在線粒體外膜等處，分為兩大類:促凋亡類，如 Bid、Bax、Bak等，也就是 Bax能促進細(xì)胞凋亡;抑凋亡類，如Bcl-2、Bcl-X1等，也就是Bcl-2能抑制細(xì)胞凋亡;這兩類蛋白可通過形成異二聚體發(fā)揮相互拮抗或放大作用，因此研究Bcl-2和Bax的表達趨勢是決定細(xì)胞凋亡與否的主要因素。

表3 各組大鼠腦組織中Bcl-2和Bax的mRNA的比較(，n=15)Tab.3 Bcl-2 and Bax mRNA expression in brain tissue in different groups(，n=15)

表3 各組大鼠腦組織中Bcl-2和Bax的mRNA的比較(，n=15)Tab.3 Bcl-2 and Bax mRNA expression in brain tissue in different groups(，n=15)

Note:1)P＜0.01 compared with sham-operated group;2)P＜0.01 compared with model group;3)P＜0.01 compared with high-dose group.

Groups Bcl-2 Bax Sham-operated group 1.25±0.13 0.86±0.06 Model group 0.41±0.051) 1.92±0.241)High-dose group 1.18±0.092) 0.91±0.032)Low-dose group 0.83±0.113) 1.44±0.173)

冠心舒通膠囊由廣棗、丹參、丁香、冰片、天竺黃等組成［9］，其中廣棗的有效藥理成分為廣棗總黃酮，動物實驗表明能顯著延長小鼠的耗氧速度、提高小鼠耐缺氧的能力、顯著延長小鼠痛覺反應(yīng)潛伏期(熱板法)或顯著減少醋酸刺激引起的扭體反應(yīng)次數(shù)［10］;天竺黃對離體兔耳血管有直接擴張作用，小鼠實驗有顯著抑制毛細(xì)血管通透性作用［10］;丹參的有效成分是丹參酮臨床試驗結(jié)果表明能改善冠心病、心絞痛和胸悶等癥狀［12］，且以往的研究［13-15］表明:廣棗能抑制心肌細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡;丹參抗神經(jīng)元細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡且能促進腫瘤細(xì)胞凋亡;丁香、冰片及天竺亦具有抗海馬神經(jīng)元凋亡和促進腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，其根本在于這5種有效成分能通過阻止線粒體膜電位的下降和線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，抑制線粒體促凋亡的蛋白質(zhì)如細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)等的釋放，從而防止細(xì)胞凋亡發(fā)生。因此本實驗復(fù)制大鼠腦I/R損傷模型，給予高、低劑量的冠心舒通后檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及腦組織Bcl-2和Bax的蛋白及mRNA的表達水平，實驗結(jié)果表明冠心舒通高劑量和低劑量組大鼠測試潛伏期均縮短、經(jīng)過平臺次數(shù)均增多、平臺象限停留時間均增加(P＜0.01)，且冠心舒通高劑量組好于冠心舒通低劑量組有顯著差異(P＜0.01);冠心舒通高劑量組血清和腦組織中Bax蛋白含量及 mRNA水平略升高、Bcl-2蛋白含量及mRNA水平略降低但無顯著差異(P＞0.05)，低劑量組大鼠血清和腦組織中Bax蛋白含量及mRNA水平升高、Bcl-2蛋白含量及mRNA水平降低有顯著差異(P＜0.01)，腦I/R模型組大鼠血清和腦組織中Bax蛋白含量及mRNA水平明顯升高、Bcl-2蛋白含量及mRNA水平明顯降低有顯著差異(P＜0.01)，提示冠心舒通能提高腦I/R損傷大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力;能下調(diào)Bax蛋白、上調(diào)Bcl-2蛋白的水平對腦I/R損傷大鼠的腦組織具有保護作用;并證實冠心舒通高劑量組好于低劑量組，這是冠心舒通治療缺血性腦血管病作用機制之一，其他機制有待于進一步的研究。

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