王曉曼 陳志磊 王少毅 許振國 楊瑞強(qiáng) 張樹全 曹志然

(河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，保定 071000)

布魯菌是一種革蘭氏陰性菌，能在細(xì)胞內(nèi)繁殖生存引起布魯菌病(Brucellosis)，是反芻動(dòng)物中常見的一種疾病，在人類中則引起波浪熱。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)全球每年有500 000的新增病例［1］。盡管目前治療布魯菌病的藥物及方法很多，尤其是我國學(xué)者研究出了許多中藥方劑，并施以中西醫(yī)結(jié)合治療的方法，取得了較好治療效果。但由于布魯菌屬于細(xì)胞內(nèi)感染，抗生素等藥物很難進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)將其徹底清除，因此，目前尚無安全有效的治療措施。

黃芪多糖(Astragalus polysaccharides，APS)是從黃芪中提取的生物活性成分之一，近年來研究發(fā)現(xiàn)，APS具有免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗炎癥、抗輻射、抗腫瘤、抗氧化、抗應(yīng)激、保肝護(hù)肝、雙向調(diào)節(jié)血糖和保護(hù)心血管系統(tǒng)等作用［2］。本文通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究黃芪多糖對(duì)布魯菌感染的巨噬細(xì)胞(Macrophage，MΦ)的調(diào)節(jié)作用，探討其在免疫調(diào)節(jié)方面的作用及作用機(jī)制，為中藥在布魯菌病的治療方面提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與菌株 雌性BALB/c小鼠，6～8周齡，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)(1211063)。布魯菌 S2株為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要儀器和試劑 倒置顯微鏡(CKX41SF，日本Olympus Corporation);二氧化碳培養(yǎng)箱(HF90，中國香港力康生物醫(yī)療科技控股有限公司);全自動(dòng)酶標(biāo)儀(ELX-800，美國寶特有限公司);潔凈工作臺(tái)(SW-CJ-2FD，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);黃芪多糖注射液(齊魯動(dòng)物保健品有限公司);RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司產(chǎn)品);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品);TNF-α、IFN-γ、IL-12 ELISA檢測(cè)試劑盒(美國R＆D Systems MIF00公司);胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(美國Sigma公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組與處理 6～8周齡雌性BALB/c小鼠120只，隨機(jī)分為4組，每組30只。實(shí)驗(yàn)設(shè)為對(duì)照組，APS低劑量組、APS中劑量組和APS高劑量組4組。分別給予濃度為0 mg/ml(對(duì)照組)、0.4、1.2、3 mg/ml的 ASP 1 ml腹腔注射，1 次/d，連續(xù)3 d。第4天 給小鼠腹腔注射密度為1×107L－1的布魯氏菌1 ml，并繼續(xù)給予不同濃度APS。

1.2.2 各組小鼠腹腔MΦ對(duì)布魯菌吞噬率和吞噬指數(shù)的測(cè)定 取5只S2株感染后1 h小鼠，腹腔注射5 ml無菌PBS，輕柔腹壁，眼球放血處死小鼠，分離血清備用。打開腹腔，吸出腹腔液4 ml，1 500 r/min×5 min離心，取部分沉淀細(xì)胞涂片(其余細(xì)胞用于載菌量測(cè)定)，瑞氏-吉姆薩染色，油鏡下計(jì)算吞噬率:吞噬率=(吞噬細(xì)菌的MΦ細(xì)胞數(shù)/MΦ細(xì)胞總數(shù))×100%;并計(jì)算吞噬指數(shù):吞噬指數(shù)=(200個(gè)MΦ吞菌總數(shù)/200個(gè)MΦ)×100%，并拍片。

1.2.3 不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠腹腔MΦ和脾臟載菌量的測(cè)定 分別取感染后的6、12、24、48、72 h的小鼠5只，眼球放血處死，分離血清備用。按1.2.2方法取腹腔液，貼壁2 h去除未貼壁細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2 ×106ml－1，取1 ml細(xì)胞加入1 ml Tritonx-100細(xì)胞裂解液，15 min后混勻，取10 μl裂解液進(jìn)行倍比稀釋后，均勻涂布于TSA固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)72 h后觀察集落形成情況，取菌落形成單位在100～300范圍內(nèi)的培養(yǎng)皿，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)并計(jì)算細(xì)胞內(nèi)載菌量，結(jié)果以CFU/100 cell表示;

同時(shí)無菌操作摘除小鼠脾臟，稱重，加入2 ml裂解液制成勻漿，15 min后混勻，取10 μl上清，倍比稀釋后，均勻涂布于TSA固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)72 h后計(jì)數(shù)集落數(shù)，計(jì)算脾臟載菌量，結(jié)果以CFU/g表示。

1.2.4 不同時(shí)間點(diǎn)小鼠血清中TNF-α、IL-12、IFN-γ的分泌量的檢測(cè) 均采用ELISA法，按試劑盒說明操作。

1.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均在計(jì)算機(jī)SPSS16.0軟件包內(nèi)進(jìn)行。計(jì)量數(shù)據(jù)均采用描述，采用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析和t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 APS可促進(jìn)小鼠腹腔MΦ對(duì)布魯菌S2株的吞噬作用(表1，圖1) 結(jié)果表明:在感染后1 h，各濃度的APS組MΦ對(duì)S2株的吞噬率和吞噬指數(shù)均明顯高于對(duì)照組，其中以1.2 mg/ml APS的作用最強(qiáng)，且MΦ細(xì)胞膜較完整。結(jié)果表明APS可促進(jìn)小鼠腹腔MΦ對(duì)布魯菌的吞噬，且對(duì)MΦ有一定保護(hù)作用。

2.2 APS可促進(jìn)小鼠腹腔MΦ對(duì)布魯菌S2株的殺死和清除作用 圖2結(jié)果顯示:在S2株感染后1 h，APS各濃度組MΦ內(nèi)載菌量顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，提示APS可促進(jìn)MΦ對(duì)S2株的吞噬，并呈濃度依賴性;而S2株感染后6 h，APS各濃度組MΦ內(nèi)載菌量則顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。

表1 不同濃度的APS對(duì)MΦ吞噬S2株的影響()Tab.1 Effect of different APS level on MΦ of phagocytosis S2()

表1 不同濃度的APS對(duì)MΦ吞噬S2株的影響()Tab.1 Effect of different APS level on MΦ of phagocytosis S2()

Note:1)P＜ 0.05，vs control;2)P＜ 0.05 vs 0.4 mg/ml.

5 28.16±4.28 2.11±1.62 0.4 mg/ml 5 38.64±1.251) 2.79±4.111)1.2 mg/ml 5 54.15±3.841)2) 4.06±3.151)2)3.0 mg/ml 5 49.37±2.301) 3.74±5.381)Phagocytic index 0(control)Groups n Phagocytic rate(%)

2.3 APS可促進(jìn)小鼠脾臟對(duì)布魯菌S2株的清除作用 圖3結(jié)果表明:在感染后的6 h，APS各劑量組脾臟內(nèi)的活菌數(shù)均高于對(duì)照組(P＜0.05)，而隨著病程的進(jìn)展在感染后12 h開始，APS各劑量組脾臟內(nèi)的載菌量均低于對(duì)照組(P＜0.05)，表明APS可增強(qiáng)脾臟清除布魯菌的功能。

2.4 APS可促進(jìn)小鼠體內(nèi)TNF-α的分泌 表2結(jié)果表明:布魯菌感染后1 h，小鼠血清中即可檢測(cè)到大量的TNF-α分泌，而各濃度的APS在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)均可促進(jìn)小鼠血清中TNF-α的分泌(P＜0.05)。

圖1 不同濃度的APS對(duì)MΦ吞噬S2株的影響Fig.1 Effect of different APS level on MΦ of phagoc-ytosis S2

2.5 APS可促進(jìn)小鼠體內(nèi)IL-12的分泌 表3結(jié)果表明:在布魯菌感染后1 h，小鼠血清中即可檢測(cè)到IL-12分泌，而各濃度的APS在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)血清中IL-12的水平均高于對(duì)照組(P＜0.05)。

2.6 APS可促進(jìn)小鼠體內(nèi)IFN-γ的分泌 表4結(jié)果顯示:APS各濃度組，在感染后6 h開始血清中IFN-γ的濃度與對(duì)照組相比明顯增高(P＜0.05)，在24 h達(dá)高峰。

圖2 各組不同時(shí)間點(diǎn)MΦ的載菌量Fig.2 Bacterial load of MΦ at different time points

圖3 各組不同時(shí)間點(diǎn)脾內(nèi)載菌量的變化Fig.3 Bacterial load of spleen at different time points

表2 不同時(shí)間點(diǎn)血清中TNF-α含量變化(n=5，，pg/ml)Tab.2 TNF-α levels of serum at different time points of groups(n=5，，pg/ml)

表2 不同時(shí)間點(diǎn)血清中TNF-α含量變化(n=5，，pg/ml)Tab.2 TNF-α levels of serum at different time points of groups(n=5，，pg/ml)

Note:vs control，1)P ＜ 0.05.

8 245.66±1.54 274.58±1.26 250.48±1.57 0.4 mg/ml 453.14±5.971) 715.42±6.411) 879.47±6.781) 769.54±0.491) 766.55±1.541) 748.12±5.541)1.2 mg/ml 475.44±1.991) 704.93±0.171) 988.47±3.151) 884.24±1.661) 894.11±1.251) 796.45±0.171)3 mg/ml 458.54±1.251) 755.85±2.781) 1130.54±2.171) 1004.74±0.411) 997.45±7.261) 876.54±6.181)1 h 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h Control 231.93±1.17 314.93±2.24 297.97±3.1 Group TNF-α

表3 不同時(shí)間點(diǎn)血清中IL-12的含量變化(n=5，，pg/ml)Tab.3 IL-12 levels of serum at different time points of groups(n=5，，pg/ml)

表3 不同時(shí)間點(diǎn)血清中IL-12的含量變化(n=5，，pg/ml)Tab.3 IL-12 levels of serum at different time points of groups(n=5，，pg/ml)

Note:vs control，1)P ＜ 0.05.

IL-12 1±3.74 9.15±3.13 8.47±5.46 0.4 mg/ml 9.23±3.77 10.08±9.14 25.49±2.431) 43.82±2.431) 54.93±7.111) 44.84±4.141)1.2 mg/ml 9.75±1.21 8.39±6.77 64.12±3.541) 71.91±6.611) 57.02±1.251) 41.48±1.091)3 mg/ml 9.45±336 10.91±1.16 41.08±1.321) 50.99±1.711) 37.19±4.121) 25.07±2.931)1 h 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h Control 8.201±1.09 9.76±2.13 8.96±6.46 10.1 Groups

表4 不同時(shí)間點(diǎn)血清中IFN-γ含量變化(n=5，，pg/ml)Tab.4 IFN-γ levels of serum at different time points of groups(n=5，，pg/ml)

表4 不同時(shí)間點(diǎn)血清中IFN-γ含量變化(n=5，，pg/ml)Tab.4 IFN-γ levels of serum at different time points of groups(n=5，，pg/ml)

Note:vs control，1)P ＜ 0.05.

.55±3.91 39.82±4.01 31.03±1.45 0.4 mg/ml 20.38±0.24 111.96±1.281) 108.06±3.071) 145.12±4.241) 83.09±1.971) 90.14±3.661)1.2 mg/ml 22.84±3.67 82.11±2.541) 68.55±4.191) 109.05±0.581) 67.01±4.421) 57.99±3.161)3 mg/ml 23.15±0.65 58.73±1.951) 61.86±3.521) 62.09±4.971) 58.08±1.561) 57.09±5.271)1 h 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h Control 21.02±4.28 20.11±3.02 29.09±1.23 33 Groups IFN-γ

3 討論

布魯菌病是由布魯菌引起的多器官損傷的慢性感染性疾病。布魯菌為兼性細(xì)胞內(nèi)寄生菌，MΦ是其侵襲的主要靶細(xì)胞［3］，研究表明布魯菌可產(chǎn)生多種毒力因子從而來逃避MΦ的殺傷作用，在MΦ內(nèi)形成有利于其生存和繁殖的微環(huán)境［4，5］，并引起感染MΦ的凋亡［6］;布魯菌的某些成分如LPS、Ⅳ型分泌系統(tǒng)及脂蛋白等可通過多種機(jī)制抑制機(jī)體的固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，從而導(dǎo)致慢性持續(xù)性感染的形成，并造成多器官損傷［7，8］。

目前WHO推薦的布魯菌病的治療方案為:多西環(huán)素聯(lián)合利福平或鏈霉素的聯(lián)合治療方案［9］。雖取得一定療效，但由于布魯菌為細(xì)胞內(nèi)寄生菌，抗生素不能進(jìn)入被感染的細(xì)胞內(nèi)，從而無法達(dá)到有效的細(xì)胞內(nèi)治療濃度，故此治療方案易出現(xiàn)病情反復(fù)，使本病難以根治，臨床治療常以緩解臨床癥狀為目的。

中醫(yī)中藥療法具有療效確切，運(yùn)用靈活、易被患者接受等優(yōu)點(diǎn)，蘊(yùn)有極大的潛力，已成為我國防治研究布魯菌病的重要組成成分。許多中藥中提取出中藥多糖成分，如黨參多糖、黃芪多糖、豬芩多糖、淫羊藿多糖和紫菜多糖等，具有無細(xì)胞毒性的特點(diǎn)，是一種重要的生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑。

黃芪多糖(APS)是黃芪的主要有效成分之一，已有研究表明APS作為生物免疫調(diào)節(jié)劑，主要通過以下機(jī)制發(fā)揮作用:①激活MΦ、NK和補(bǔ)體系統(tǒng)，誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子，如 IFN-γ、TNF-α等，增強(qiáng)機(jī)體的固有免疫;②促進(jìn)CD8+T淋巴細(xì)胞分化為有殺傷活性的Tc細(xì)胞，增強(qiáng)細(xì)胞免疫;③提高B淋巴細(xì)胞的數(shù)量與活性，增強(qiáng)體液免疫;④調(diào)節(jié)神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò);⑤促進(jìn)細(xì)胞中RNA、DNA和蛋白質(zhì)的合成，提高細(xì)胞內(nèi)環(huán)核苷酸(cGMP、cAMP)的含量，調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)途徑［10-13］。但目前有關(guān)APS在抗布魯菌感染中的作用未見報(bào)道。本文通過預(yù)先給小鼠腹腔注射不同劑量的APS，然后再進(jìn)行布魯菌S2株的腹腔感染，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在感染后1 h APS各劑量組腹腔MΦ的吞噬率、吞噬指數(shù)和MΦ內(nèi)的載菌量均高于對(duì)照組，其主要作用機(jī)制為APS促進(jìn)了MΦ對(duì)布魯菌的吞噬功能，故在感染后1 h MΦ的吞噬率和吞噬細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量均明顯高于對(duì)照組;從感染后6 h開始APS組MΦ內(nèi)的載菌量則又明顯低于對(duì)照組，且隨感染時(shí)間的延長細(xì)胞內(nèi)的載菌量隨之減少，其機(jī)制主要為:① APS激活了MΦ并增強(qiáng)了其殺傷活性，殺死了吞入細(xì)胞內(nèi)的大部分細(xì)菌;②APS促進(jìn)部分吞噬了布魯菌的MΦ遷移至脾臟，由脾內(nèi)MΦ進(jìn)一步清除。另外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在各實(shí)驗(yàn)組感染后24 h對(duì)照組的載菌量較12 h時(shí)又有所增高，其原因可能是部分布魯菌能夠通過某種機(jī)制逃脫了吞噬細(xì)胞的殺菌作用，從而得以在細(xì)胞內(nèi)繼續(xù)生存、繁殖，這也是造成布魯菌持續(xù)感染的重要原因之一，但各APS組的載菌量仍低于對(duì)照組，進(jìn)一步說明了ASP可促進(jìn)MΦ的吞噬殺菌作用。

由于腹腔內(nèi)感染的細(xì)菌可以進(jìn)入脾臟進(jìn)一步被脾內(nèi)的MΦ清除，因此本文進(jìn)一步觀察了感染后不同時(shí)間點(diǎn)脾臟載菌量的變化，結(jié)果表明感染后6 h APS組脾內(nèi)的載菌量高于對(duì)照組，其主要機(jī)制一是促進(jìn)了脾臟MΦ對(duì)布魯菌的吞噬，再有就是APS促進(jìn)了吞噬布魯菌后腹腔MΦ向脾內(nèi)的遷移;在感染后12 h開始APS組小鼠脾內(nèi)的載菌量又顯著低于對(duì)照組，提示APS可促進(jìn)脾臟MΦ對(duì)布魯菌的殺死和清除作用。本實(shí)驗(yàn)中在感染后的48 h各實(shí)驗(yàn)組的載菌量又有所增加，其主要原因與細(xì)胞內(nèi)存活的布魯菌的繁殖有關(guān)，但APS各劑量組的載菌量均低于對(duì)照組。

研究表明MΦ的抗布魯菌感染作用除直接吞噬殺死病原體外，還可通過釋放 TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12等多種細(xì)胞因子，激活樹突狀細(xì)胞;并可提呈抗原、誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答等參與抗感染免疫［6］。TNF-α為機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生最早的炎癥介質(zhì)，是啟動(dòng)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子［14］;MΦ產(chǎn)生的IL-12能誘導(dǎo)T細(xì)胞和NK細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其產(chǎn)生IFN-γ，IFN-γ可以顯著促進(jìn)MΦ FcγR的表達(dá)，從而提高M(jìn)Φ的吞噬能力。為了進(jìn)一步研究APS的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)和機(jī)制，本文檢測(cè)了感染后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠血清中部分細(xì)胞因子水平的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在感染后1 h APS組小鼠血清中TNF-α的分泌明顯高于對(duì)照組;APS組IL-12的分泌在感染后6 h開始明顯高于對(duì)照組，在48 h達(dá)高峰，72 h又開始下降;IFN-γ的分泌則在感染后6 h APS組與對(duì)照組出現(xiàn)明顯的差異，24 h達(dá)高峰，48 h后開始下降。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示APS可促進(jìn)TNF-α和IL-12的分泌，但分泌的時(shí)相存在差異。IFN-γ是Th1分化的重要標(biāo)志性細(xì)胞因子，本研究結(jié)果提示APS促進(jìn)了Th1的分化，增強(qiáng)了機(jī)體抗布魯菌的細(xì)胞免疫應(yīng)答。

綜上，APS可能通過促進(jìn)小鼠MΦ對(duì)布魯菌的吞噬和殺傷，并促進(jìn)TNF-α、IL-12及IFN-γ的分泌，從而在抗布魯菌感染中發(fā)揮重要作用。

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