陳松彪 李 靜 尚 珂 郁 川 張春杰 程相朝 李銀聚 趙戰(zhàn)勤

(河南省動物疫病與公共安全院士工作站/河南科技大學動物疫病與公共衛(wèi)生重點實驗室，洛陽 471003)

雞白痢是由雞白痢沙門菌引起的雞的傳染病。本病特征為幼雛感染后常呈急性敗血癥，發(fā)病率和死亡率都高，成年雞感染后，多呈慢性或隱性帶菌，可隨糞便排出，因卵巢帶菌，嚴重影響孵化率和雛雞成活率。雞白痢沙門菌具有高度宿主適應性。本菌為兩端稍圓的細長桿菌［(0.3～0.5)μm×(1～2.5)μm］，對一般堿性苯胺染料著色良好，革蘭氏陰性。細菌常單個存在，很少見到兩菌以上的長鏈。在涂片中偶爾可見到絲狀和大型細菌。本菌不能運動，不液化明膠，不產生色素，無芽胞，無莢膜，兼性厭氧。目前，雞白痢沙門菌仍是我國養(yǎng)雞業(yè)中危害嚴重的細菌之一，能造成巨大的經濟損失。國內常采用藥物控制該菌，但同時造成了細菌耐藥性和藥物殘留等問題。此外，在實際生產中沒有實施嚴格的檢疫淘汰措施，使得雞群中的雞白痢陽性率仍較高。盡管許多國家逐漸使用活疫苗預防來控制沙門菌病，取得了很好的效果，但是由于雞白痢沙門菌在發(fā)達國家基本消滅且不感染人，有關它的疫苗研究報道較少，而已有的滅活疫苗的保護水平往往較低而不能產生堅實的免疫力。

近年來，利用基因工程技術將強毒株毒力相關基因敲除構建新型減毒沙門菌作為疫苗的研究備受關注，通過基因工程方法減毒的沙門菌對人和動物的致病力顯著降低，但仍然保持良好的安全性和免疫原性［1-3］。同時該類減毒株能有效地刺激機體產生黏膜免疫、細胞免疫和體液免疫應答，已被證明是攜帶外源基因的良好載體［4］，但是由于生存壓力，沙門菌所攜帶的真核或者原核質粒在體內部可能穩(wěn)定的存在，且質粒攜帶的抗性基因可能給動物安全帶來了潛在性的威脅，近年來發(fā)展出來的宿主平衡致死的方法能有效解決質粒攜帶外源基因表達不穩(wěn)定性的問題，運用asd(天冬氨酸-β半乳糖脫氫酶)基因平衡致死系統(tǒng)，asd缺失菌株在無外源DAP(二氨基庚二酸)存在的條件下會發(fā)生死亡，質粒載體中含有asd基因，與宿主菌Δasd缺失株表型互補，使重組菌在無外源DAP存在的條件下仍能存活［5］，C79-13Δcrp由筆者所在的實驗室程相朝等在C79-13基礎上構建的減毒株［6］，與親本株相比其毒力大大降低。對于crp基因的特性、功能作用等方面的研究雖然在國內外一些沙門菌研究中有一定的報道，但有關雞白痢沙門菌C79-13ΔcrpΔasd缺失株平衡致死載體系統(tǒng)的研究目前尚未見有相關報道。本研究旨在C79-13Δcrp的基礎上構建減毒雞白痢沙門C79-13ΔcrpΔasd缺失株平衡致死載體系統(tǒng)，研究其生物學特性，進而為研發(fā)更加安全有效的雞白痢弱毒疫苗以及開發(fā)以雞白痢沙門菌C79-13為載體的多價疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒 雞白痢沙門菌C79-13強毒株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)督所，無抗性原核表達載體pYA3493(asd+，pBRori，β-lactamase signal sequence)及其宿主菌χ6097(araΔ(lac-pro)rPslΔasdA4Δ［zhf-2::Tn10］thiф80d/lacZΔM15) 質粒由美國華盛頓大學Dr.Roy Curtiss III教授惠贈，減毒雞白痢沙門菌C79-13Δcrp、含缺失315 bp的重組自殺性質粒由筆者所在的實驗室構建并保存。

1.2 主要試劑和培養(yǎng)基 各種生化鑒定試劑購自杭州天和微生物試劑有限公司;沙門菌屬診斷血清(11種)及各種單因子血清購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司;蔗糖、DAP購自美國Sigma-Aldrich公司;Taq DNA 聚合酶、dNTPs、DNA Marker、T4 DNA Ligase和各種限制性內切酶均購自寶生物工程(大連)有限公司;麥芽糖、Amp、Cm、DAP、細菌基因組 DNA提取試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司;質粒小量提取試劑盒購自美國MOBIO Laboratories公司;DNA膠回收試劑盒購自臺灣Geneaid Biotech公司;麥康凱瓊脂和SS瓊脂培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;胰蛋白胨、酵母浸出物等購自英國OXOID公司。

1.3 培養(yǎng)條件和抗生素濃度 大腸桿菌和雞白痢沙門菌在各種培養(yǎng)基中37℃靜止或振搖培養(yǎng)，根據(jù)需要加入終濃度25 μg/ml的氯霉素(Chloram-phenicol，Cm)，50 μg/ml的二氨基庚二酸(D L-α，ε-Diaminopimelic acid，DAP)。

1.4 實驗動物 1日齡健康羅曼雛雞，按常規(guī)方法檢測均為沙門菌抗體陰性。

1.5 引物的設計和合成 根據(jù)GenBank上已公布的雞白痢沙門菌LT2(GenBank No.AE008859)及相關文獻設計相關引物［7］，各引物由生工(上海)有限公司合成，見表1。

1.6 接合轉移和ΔcrpΔasd缺失株的篩選 根據(jù)文獻［5］的方法，二步法篩選基因缺失突變株。以減毒雞白痢沙門菌C79-13Δcrp為受體菌，χ7213(pREΔasd)為供體菌進行接合轉移。供體菌和受體菌分別培養(yǎng)過夜，各取100 μl菌懸液混合，補充含有DAP的LB液體培養(yǎng)液1 ml，培養(yǎng)過夜，取適量菌液涂布于含Cm和5%蔗糖的LB固體平板上培養(yǎng)，挑取Cm抗性(Cmr)蔗糖敏感(SUCs)菌落，用引物Pa5/Pa6擴增鑒定，同時設供體菌和受體菌對照。陽性接合子在含5%蔗糖無抗性無NaCl的含有DAP的LB(NB)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，連續(xù)10倍稀釋，選取合適的稀釋度涂布于含有DAP的LB固體平板，篩選ΔcrpΔasd缺失菌株。將細菌劃線接種于含氯霉素的LB固體平板中檢測其抗性，進一步提取陽性缺失菌株基因組，用引物Pa5/Pa6、Pa6/Pa7 PCR擴增鑒定，并將引物Pa6/Pa7進行PCR擴增產物送生工生物工程(上海)有限公司進行序列測定。

表1 PCR擴增所用的引物序列Tab.1 Primer sequences for PCR amplification

1.7 ΔcrpΔasd缺失株的表型鑒定 將Δasd缺失株進行血清型鑒定，同時將缺失株C79-13ΔcrpΔasd與親本株C79-13Δcrp劃線接種于含和不含1%麥芽糖的麥康凱平板，然后將細菌轉接至葡萄糖、蔗糖、甘露醇、阿拉伯糖等生化鑒定管研究其生化特性情況。

1.8 ΔcrpΔasd缺失株遺傳穩(wěn)定性測定 將缺失株C79-13ΔcrpΔasd于含DAP的LB培養(yǎng)基中連續(xù)傳代60代，挑取第 10、20、30、40、50、60 代單菌落，用Pa7/Pa6引物進行PCR擴增鑒定，以研究asd缺失基因在Δasd缺失株中的遺傳穩(wěn)定性。

1.9 ΔcrpΔasd缺失株的基因互補試驗 將表達asd基因的空載體pYA3493電轉入C79-13ΔcrpΔasd缺失株，看重組菌株在無DAP的LB培養(yǎng)基中能否生長，以及在體外連續(xù)傳代培養(yǎng)看互補質粒能否穩(wěn)定存在。以研究ΔcrpΔasd缺失株作為載體攜帶外源質粒的穩(wěn)定性。

1.10 ΔcrpΔasd缺失株的生長特性鑒定 缺失株C79-13ΔcrpΔasd與親本株 C79-13、C79-13Δcrp 分別在含DAP和不含DAP的LB中37℃培養(yǎng)過夜，無菌生理鹽水連續(xù)10倍稀釋，取100 μl適當稀釋度菌液均勻涂布于含DAP和不含DAP的LB固體平板上，每個稀釋度做3個重復，37℃培養(yǎng)過夜，計數(shù)，取平均值計算原液的CFU。然后以終濃度約為106CFU/ml轉接于相同液體培養(yǎng)基，37℃、200 r/min培養(yǎng)，每1 h取樣并進行涂板計數(shù)，繪制生長曲線。

1.11 ΔcrpΔasd(PYA3493)缺失株的毒力測定 缺失株C79-13ΔcrpΔasd(PYA3493)與親本株 C79-13在LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，按1.9所述方法平板計數(shù)并計算攻毒劑量，無菌生理鹽水連續(xù)10倍稀釋，選取合適的稀釋度，每個稀釋度口服感染10只1日齡羅曼雛雞，每只500 μl，觀察直至無雛雞死亡，同時設生理鹽水空白對照組。將死亡雛雞肝臟無菌接種SS和含有1%麥芽糖的麥康凱固體平板，用引物pi1/pi2進行PCR擴增鑒定，記錄死亡情況，根據(jù)Bliss法計算菌株對雛雞半數(shù)致死量(LD50)。

2 結果

2.1 缺失菌株C79-13ΔcrpΔasd的篩選和鑒定 大腸桿菌 χ7213(pREΔasd)與雞白痢沙門菌 C79-13Δcrp接合轉移后發(fā)生第一次同源臂間的單交換，用asd一條上臂內部引物Pa5和一條下臂內部引物Pa6擴增子，得到約為1 803 bp和315 bp兩條帶(見圖1A)。陽性接合子呈Cm抗性，但同時對蔗糖敏感。由于自殺性質粒 pREΔasd被整合到 C79-13Δcrp染色體上，asd就有兩個拷貝，出現(xiàn)缺失型大小和野生型大小兩條帶。pREΔasd含有負向選擇基因(sacB蔗糖敏感基因)，陽性接合子在5%蔗糖無抗性無NaCl含DAP的LB(NB)培養(yǎng)基連續(xù)傳代培養(yǎng)中發(fā)生第二次同源重組，用引物Pa5/Pa6擴增產生兩種結果，一種是突變型大小為315 bp，一種是恢復野生型大小為1 803 bp(見圖1)。為了進一步證明該同源重組是發(fā)生在C79-13Δcrp的染色體而不是重組自殺性質粒上，用asd一條下臂內部引物Pa6和一條上臂以外染色體上的引物Pa7對陽性缺失株進行PCR鑒定，同樣有兩種結果，缺失菌株擴增出2 229 bp片段，野生型擴增出 3 717 bp片段，而pREΔasd無任何條帶(見圖1B)。此時，缺失菌株呈Cm敏感和蔗糖抗性。序列測定結果也與理論預測相一致，這表明缺失菌株構建成功，將此缺失菌株命名為 C79-13ΔcrpΔasd。

圖1 PCR鑒定缺失菌株C79-13ΔcrpΔasdFig.1 PCR identification of C79-13ΔcrpΔasd mutant

2.2 缺失株C79-13ΔcrpΔasd的表型鑒定 血清型鑒定表明，缺失株C79-13ΔcrpΔasd的血清型沒有變化，單因子血清型鑒定仍為O9型。生化鑒定結果表明，缺失株C79-13ΔcrpΔasd的生化特性與親本株C79-13相比，發(fā)生了明顯的變化。

2.3 缺失株C79-13ΔcrpΔasd遺傳穩(wěn)定性測定 缺失株C79-13ΔcrpΔasd在含DAP的LB固體平板上連續(xù)培養(yǎng)60代，應用引物Pa7/Pa6 PCR擴增鑒定第10、20、30、40、50、60 代的單菌落，都能得到缺失型的2 229 bp的Δasd片段(圖2)，這表明缺失株C79-13ΔcrpΔasd能夠穩(wěn)定遺傳缺失1 488 bp的asd基因片段。

2.4 C79-13ΔcrpΔasd缺失株的基因互補試驗 將空載體PYA3493電轉化到C79-13ΔcrpΔasd感受態(tài)中，篩選出來的陽性重組子在LB固體平板上能夠生長，說明PYA3493能表達asd基因，并且重組菌株在LB固體平板上連續(xù)培養(yǎng)30代不丟失，此載體能夠在雙缺失株中穩(wěn)定存在。

2.5 缺失菌株C79-13ΔcrpΔasd生長特性鑒定C79-13ΔcrpΔasd、C79-13ΔcrpΔasd(PYA3493) 分別涂布含DAP和不含DAP及10 g/L麥芽糖的麥康凱平板，C79-13涂布含10 g/L麥芽糖的麥康凱平板，培養(yǎng)24 h后，平均菌落直徑是0.5、1.0、1.24 mm。以106CFU/ml的初始菌液濃度進行培養(yǎng)，每隔1 h取樣，平板計數(shù)。以取樣時間為橫軸，以每小時所測菌落的對數(shù)值為豎軸繪制三種細菌的生長曲線(如圖3)。結果表明，缺失菌株 C79-13ΔcrpΔasd的生長速度明顯低于強毒株C79-13，而C79-13ΔcrpΔasd(PYA3493)和C79-13ΔcrpΔasd生長速度相差不大。

2.6 缺失菌株C79-13ΔcrpΔasd的毒力測定 雛雞經親本菌株C79-13口服感染后，發(fā)生死亡。但無菌生理鹽水和空白對照組雛雞均未發(fā)生死亡。引物pi1/pi2均能從死亡雛雞分離的細菌擴增出約580 bp的特異性DNA條帶(見圖4)，剖檢死亡雛雞具有典型沙門菌病變。這表明感染雛雞的細菌是沙門菌。應用Bliss法計算(見表2)，C79-13的口服感染 LD50為1.9×106CFU，缺失菌株 C79-13ΔcrpΔasd(PYA3493)口服感染LD50為1.7×109CFU，其毒力與親本菌株C79-13相比下降了近99.9%。這表明缺失菌株C79-13ΔcrpΔasd與親本菌株 C79-13相比毒力明顯降低。

表2 缺失菌株C79-13ΔcrpΔasd與親本菌株C79-13的生化特性比較Tab.2 Comparison of biological characterization between C79-13ΔcrpΔasd mutant and C79-13

表3 缺失菌株C79-13ΔcrpΔasd和C79-13的毒力測定Tab.3 Mortality of chick infection with C79-13ΔcrpΔasd or C79-13 strain

圖2 PCR鑒定缺失菌株C79-13ΔcrpΔasd的穩(wěn)定性Fig.2 PCR identification of stability of C79-13ΔcrpΔasd mutant

圖 3 缺失菌株C79-13ΔcrpΔasd，C79-13ΔcrpΔasd(PYA3493)與CFU生長曲線Fig.3 Growth curves of C79-13ΔcrpΔasd，C79-13ΔcrpΔasd(PYA3493)and C79-13 base on CFU

圖4 沙門菌的PCR擴增鑒定Fig.4 PCR identification of Salmonella

3 討論

雞白痢沙門菌是養(yǎng)雞業(yè)中引起嚴重危害的細菌之一，能造成巨大的經濟損失。國內常采用藥物控制該菌，但同時也造成了細菌耐藥性和藥物殘留等問題［8］。此外，在實際生產中也沒有實施嚴格的檢疫淘汰措施，使得雞群中的陽性率仍較高。最近幾年，許多國家逐漸轉向使用疫苗預防來控制其他沙門菌病，取得了很好的效果［9］，由于雞白痢沙門菌不感染人，其研究報道并不多，而針對雞白痢的疫苗控制的報道卻較少。在我國現(xiàn)有的飼養(yǎng)條件下，對雞白痢的疫苗免疫值得我們嘗試。

近年來，利用基因工程構建減毒沙門菌作疫苗的研究備受關注，減毒活疫苗比滅活疫苗和亞單位疫苗在預防控制沙門菌病方面更有優(yōu)勢。通過傳統(tǒng)的抗生素誘導或化學誘導獲得的弱毒株，存在毒力不穩(wěn)定容易返強的潛在危險。目前減毒鼠沙門菌作為疫苗載體的效果和安全性已被大量的動物和人體試驗所證實［10］。減毒沙門菌既可以作為疫苗株，又可以作為運送載體表達外源基因。同時，攜帶外源基因的減毒菌可以通過自然感染途徑，如口服或鼻內接種，引起動物較強的黏膜免疫應答，具有操作簡單、對動物損傷小等優(yōu)點。因此，近年來，以減毒沙門菌作為活疫苗表達載體的研究已成為一個熱點。黏膜免疫與多價疫苗是未來免疫預防的重要方向，以細菌為載體的重組活疫苗被認為是最有前景的研究領域之一。

質粒平衡致死載體系統(tǒng)是解決外源質粒不能穩(wěn)定遺傳的有效途徑。asd基因編碼的天冬氨酸β-半乳糖脫氫酶是DAP生物合成途徑中的必需酶，而DAP是革蘭氏陰性菌細胞壁主要化學成分肽聚糖四肽側鏈的一個組分，asd突變株在無外源DAP條件下不能形成完好的細胞壁，最終溶菌死亡。同時，由于哺乳動物組織中不含DAP，因此，突變菌在動物體內均被降解。質粒PYA3493是含有asd基因的表達質粒，可攜帶外源基因轉化本研究構建的C79-13ΔcrpΔasd，質粒上的asd基因可與突變菌形成互補，從而解決了突變菌不能在DAP陰性環(huán)境中生存的問題。crp基因編碼cAMP受體蛋白，其突變株影響碳水化合物的合成及菌毛和鞭毛的合成。郁川等［10］指出，crp基因是沙門菌的重要毒力基因之一，缺失crp基因可明顯降低沙門菌的毒力，但仍保留了其免疫原性。

本研究以缺失了crp基因的雞白痢沙門菌C79-13為受體菌，降低了C79-13的毒力，消除了毒力返強的風險，然后與χ7213(pREΔasd)接合轉移，成功構建了asd基因突變株，并與含asd基因的質粒PYA3493形成營養(yǎng)互補，用于高效表達外源基因。生物學特性研究表明缺失菌株C79-13ΔcrpΔasd不能再利用麥芽糖、甘露醇等部分碳源，但仍能利用葡萄糖和果糖作為碳源物質，這與 Rosu［11］利用轉座子構建的雞白痢沙門菌crp缺失菌株相一致。其生長速度與親本菌相比發(fā)生了明顯的變化，其能穩(wěn)定遺傳缺失了的asd基因，其毒力與親本相比發(fā)生了顯著的降低。

綜上所述，本研究成功構建了雞白痢沙門菌C79-13株ΔcrpΔasd缺失株平衡致死載體系統(tǒng)，并對其生物學特性進行了一系列的研究。該系統(tǒng)在無外源選擇壓力的條件下能夠穩(wěn)定遺傳asd基因，并且外源質粒PYA3493能夠穩(wěn)定存在于該系統(tǒng)中，這與張明亮等報道的豬霍亂沙門菌［12］的結果一致，能夠克服以往外源基因不穩(wěn)定遺傳的問題，同時，該系統(tǒng)沒有任何抗生素基因的標記，不會產生生物安全的問題，并且這為將雞白痢沙門菌C79-13突變株開發(fā)成安全高效的疫苗活載體奠定了基礎。然而減毒雞白痢沙門菌作為疫苗，由于具有宿主特異性，不能傳染給人，這是其他非宿主特異性沙門菌所不具備的，然而要想成為一株理想的疫苗候選株還有許多問題需要解決，這還需要我們進一步的臨床試驗。

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