張智偉 蔡 琨 吳瑪莉 于紅紅 冷 泠 岳文鵬 田維毅

(貴陽中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽 550002)

紫花地丁載于《本草綱目》，具有清熱解毒、涼血消腫、消癰散結(jié)的功效。臨床報(bào)道，紫花地丁常用于治療腮腺炎、蜂窩組織炎、癤腫、靜脈炎、自身免疫性不孕、過敏性紫癜性腎炎等炎癥性和免疫性疾?。?-6］。巨噬細(xì)胞是機(jī)體炎癥和免疫反應(yīng)的重要調(diào)控因素，其功能狀況與機(jī)體炎癥/免疫過程密切相關(guān)。巨噬細(xì)胞表面Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類重要模式識別受體，在巨噬細(xì)胞上有大量分布，是其活化和釋放炎癥細(xì)胞因子的重要信號通路［7］。巨噬細(xì)胞Toll樣受體在哺乳動(dòng)物已發(fā)現(xiàn)13個(gè)成員，其中以TLR-1～5的研究尤為多見。在我們前期研究中發(fā)現(xiàn)，紫花地丁含藥血清在一定濃度下對巨噬細(xì)胞分泌NO、TNF-α和IL-6具有顯著調(diào)節(jié)作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，在炎癥反應(yīng)初期，適量的NO、TNF-α分泌是機(jī)體對抗炎癥的積極反應(yīng)，但是如果它們持續(xù)不斷地釋放則會(huì)導(dǎo)致炎癥的不斷擴(kuò)大、加重［8］。為了進(jìn)一步探索紫花地丁干預(yù)巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子的機(jī)制，本文采用血清藥理方法，考察了紫花地丁含藥血清對巨噬細(xì)胞吞噬功能和Toll樣受體1～5mRNA表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 NU-440-400E型生物安全柜(美國Nuair)，MK3型酶標(biāo)儀(美國 Thermo)，F(xiàn)-32水浴鍋(德國 Julabo)，Biometra TProfessional Thermocycler PCR儀(德國Biometra)，CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo)，BIO-RAD GelDoc 2000凝膠成像系統(tǒng)(美國伯樂)。

1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco)，Trizol reagent(美國 Invitrogen)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與 Taq酶(大連寶生物)，PCR反應(yīng)引物(北京鼎國昌盛生物科技有限公司合成)，中性紅(上海試劑三廠)。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物 中藥紫花地丁購自北京同仁堂藥店貴陽店，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院生藥實(shí)驗(yàn)室鑒定為正品。采用常規(guī)方法制備水煎劑，按8 ml(水)∶1 g(生藥)比例，加超純水浸泡30 min，煮沸30 min，趁熱4層紗布過濾，濾液自然滴盡，第2煎按6 ml(水)∶1 g(生藥)比例加水，如前法煮沸30 min并過濾，合并兩次濾液，加熱濃縮成相當(dāng)于生藥3 g/ml的水煎液，4℃保存，1周內(nèi)使用。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 制備含藥血清選用清潔級SD大鼠，雄性，體重180～200 g;制備腹腔巨噬細(xì)胞選用清潔級KM小鼠，雌雄不分，體重18～22 g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均購自貴陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［動(dòng)物合格證SCXK(黔)2002-0001］。

1.5 紫花地丁含藥血清的制備 將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為正常血清對照組和紫花地丁含藥血清組，每組10只，紫花地丁含藥血清組每天以15 g/kg(大鼠體重)分2次(12 h 1次)灌胃，給藥體積為1 ml/100 g，對照組代以等體積生理鹽水，連續(xù)3 d。最后一次給藥前12 h禁食不禁水，每組于最后一次給藥后0.5 h開始隨機(jī)抽取1只大鼠股動(dòng)脈采血，每10 min采集1只，到2 h采完。所有血液常溫靜置4 h后3 000 r/min離心10 min，收集上清并混合，56℃30 min滅活補(bǔ)體，22 μm 過濾除菌，－80℃保存?zhèn)溆?。根?jù)前期觀察含藥血清的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用對巨噬細(xì)胞安全的5%～20%含藥血清為本實(shí)驗(yàn)的血清濃度。

1.6 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的制備 小鼠腹腔注射3%硫代乙醇酸鈉1 ml，3 d后，常規(guī)無菌操作向腹腔內(nèi)注入10 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)，輕揉腹部3～5 min，用吸管收集腹腔液，1 000 r/min離心5 min，PBS液洗滌細(xì)胞3次，棄上清，加入含15%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×106個(gè)/ml。在96孔板中，每孔加入細(xì)胞懸液100 μl，37℃、5%CO2溫育貼壁2 h后立即用于下列實(shí)驗(yàn)。

1.7 中性紅法檢測巨噬細(xì)胞吞噬活性 在上述96孔板中，將貼壁2 h后的細(xì)胞懸液棄上清，然后加入用含血清的DMEM培養(yǎng)液配制的濃度為0.002 g/ml的中性紅溶液200 μl/孔，置37℃、5%CO2培養(yǎng)3 h，棄中性紅溶液，PBS沖洗3次，每孔加入細(xì)胞裂解液(體積分?jǐn)?shù)50%的乙酸和體積分?jǐn)?shù)50%的無水乙醇的混合液)200 μl，室溫下放置24 h，待細(xì)胞溶解后，492 nm測定吸光度。

1.8 RT-PCR法檢測巨噬細(xì)胞TLR-1、TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-5 mRNA表達(dá) 取上述培養(yǎng)24 h的細(xì)胞，按說明書用Trizol法提取總RNA為模板，以O(shè)ligo-dT為引物逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。PCR引物按NCBI中Primer-BLAST設(shè)計(jì)，序列如表1。反應(yīng)條件:94℃，45 s;53℃，45 s;72℃，1 min;35 cycles。反應(yīng)體系:ddH2O 17.5 μl，10×PCR buffer 2.5 μl，10×dNTP Mix 2.5 μl，Primer1 0.5 μl，Primer2 0.5 μl，Taq plusDNA 0.5 μl，cDNA 1 μl。先將 GAPDH 電泳結(jié)果由Quantity One軟件采用等高線定量法分析，確定添加模板量，進(jìn)而調(diào)整添加模板與滅菌水的比例并進(jìn)行PCR，Quantity One軟件分析電泳結(jié)果。同時(shí)將所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，送上海生工生物工程股份有限公司單向測序，并在 NCBI中進(jìn)行BLAST分析其吻合度，結(jié)果見表1。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。檢測數(shù)據(jù)以表示，P＜0.05 為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 紫花地丁含藥血清對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 圖1結(jié)果顯示，與相同濃度正常血清對照組比較:紫花地丁含藥血清各濃度組巨噬細(xì)胞中性紅吞噬量明顯升高(P＜0.01)。

2.2 紫花地丁含藥血清對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TLR-1、TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-5 mRNA 表達(dá)的影響圖2和表2結(jié)果顯示，與相同濃度正常血清對照組比較:(1)TLR-1mRNA表達(dá)量:5%濃度組顯著升高(P＜0.01)，而10%和20%濃度組顯著降低(P＜0.05或 P＜0.01);(2)TLR-2mRNA表達(dá)量:10%濃度組量顯著降低(P＜0.01)，而20%濃度組顯著升高(P＜0.01);(3)TLR-3mRNA表達(dá)量:5%濃度組升高(P＜0.05)，而 10%濃度組顯著降低(P＜0.01);(4)TLR-4mRNA表達(dá)量:各濃度組無顯著變化(P＞0.05);(5)TLR-5mRNA表達(dá)量:各濃度組顯著升高(P＜0.01)。

表1 RT-PCR的引物及產(chǎn)物的吻合度Tab.1 Primers for RT-PCR and identities of product

表2 紫花地丁含藥血清對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TLR-1～5 mRNA表達(dá)量的影響(，n=8)Tab.2 Effects of viola-containing serum on expression level of TLR-1－5 mRNA in mouse macrophages(，n=8)

表2 紫花地丁含藥血清對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TLR-1～5 mRNA表達(dá)量的影響(，n=8)Tab.2 Effects of viola-containing serum on expression level of TLR-1－5 mRNA in mouse macrophages(，n=8)

Note:1)P＜0.05，compared with the same concentration of normal serum group;2)P＜0.01，compared with the same concentration of normal serum group.

.51 10.49±1.32 3.51±2.90 10 15.55±2.00 11.20±1.00 10.33±2.18 11.56±4.56 4.23 ±2.36 20 5.10±0.51 7.32±0.16 3.74±2.37 6.75±1.58 2.52±1.80 Viola-containing serum 5 15.12±1.602) 11.14±1.02 17.67±3.111) 10.02±1.71 11.69±3.132)10 9.54±1.412) 8.81±1.102) 3.77±1.342) 8.99±2.34 14.43±1.952)20 3.30±1.351) 8.87±0.992) 3.08±1.98 5.94±1.40 14.57±2.932)-4 TLR-5 Normal serum 5 10.53±2.73 10.45±1.89 13.09±1 Groups Serum concentration(%)%Adj.Vol.(Relative gray values)TLR-1 TLR-2 TLR-3 TLR

圖1 紫花地丁含藥血清對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響(n=8)Fig.1 Effectsofviolacontaining serum on mouse macrophages phagocytosis activity(n=8)

3 討論

圖2 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞 TLR-1、TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-5 mRNA表達(dá)Fig.2 Expression of TLR-1，TLR-2，TLR-3，TLR-4 and TLR-5 mRNA in mouse macrophages

血清藥理學(xué)方法由日本學(xué)者田代真一在上世紀(jì)80年代提出［9］。這種方法具有實(shí)驗(yàn)周期短、條件易于控制、結(jié)果易于觀察等特點(diǎn)。因其“半體內(nèi)”特點(diǎn)更貼近中藥在體內(nèi)發(fā)揮藥理作用，被廣泛應(yīng)用于中藥作用機(jī)制的研究。巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要細(xì)胞成員，具有識別和吞噬異物、提呈抗原、分泌多種活性介質(zhì)等作用，參與維持機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)［10］。靜息狀態(tài)的巨噬細(xì)胞功能低下，只有在活化狀后才能發(fā)揮較強(qiáng)的吞噬、分泌、炎癥和免疫調(diào)控等功能［10］。為了探索紫花地丁對巨噬細(xì)胞活化作用及其機(jī)制，我們考察了紫花地丁含藥血清對巨噬細(xì)胞吞噬功能和Toll樣受體1～5mRNA表達(dá)的影響。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:(1)紫花地丁含藥血清各濃度組較正常血清組巨噬細(xì)胞中性紅吞噬量明顯升高(P＜0.01);(2)紫花地丁含藥血清一定濃度組TLR-1、TLR-2和TLR-3的mRNA表達(dá)量表現(xiàn)出升高或降低(P＜0.05或 P＜0.01)，TLR-4mRNA 表達(dá)量無顯著變化(P＞0.05)，TLR-5mRNA表達(dá)量顯著升高(P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:紫花地丁含藥血清對巨噬細(xì)胞吞噬功能具有明顯促進(jìn)作用;對不同TOLL樣受體mRNA表達(dá)量的干預(yù)作用則表現(xiàn)各異。Farhat等［12］報(bào)道 TLR-1與 TLR-2可協(xié)同發(fā)揮識別作用;王梁華等［13］報(bào)道TLR-2的多抗能部分抑制LPS激活巨噬細(xì)胞吞噬金葡萄球菌的能力，也能部分阻斷對U937細(xì)胞的吞噬活性;Wang等［14］報(bào)道，在西尼羅病毒感染的小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR-3缺乏導(dǎo)致IL-6和TNF-α分泌減少;張代娟等［15］報(bào)道青心酮預(yù)處理能顯著上調(diào)可溶性Toll樣受體4(sTLR4)mRNA及蛋白表達(dá)，減少TNF-α分泌，抑制炎癥反應(yīng);趙保勝等報(bào)道，黃連解毒湯能阻斷TLR-4高表達(dá)，阻斷TLR-4胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的MyD88依賴和非依賴兩條途徑(以阻斷非依賴途徑為主)，抑制相關(guān)基因表達(dá)產(chǎn)物TNF-α、IFN-β過度分泌，具有 TLR4拮抗劑樣作用［16］;李巖等［17］報(bào)道黃芩苷可以抑制脂多糖介導(dǎo)的TLR-4表達(dá)增高，同時(shí)減弱脂多糖誘導(dǎo)的TLR4信號途徑激活，抑制I-κB降解，降低TNF-α表達(dá);Hayashi等［18］報(bào)道TLR-5可調(diào)動(dòng)核因子 NF-κB并刺激TNF-α分泌。我們前期研究顯示，一定濃度的紫花地丁含藥血清能促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、NO(P＜0.05 或 P＜0.01);而對 IL-6 分泌具有雙向調(diào)節(jié)作用(P＜0.01)。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測紫花地丁含藥血清調(diào)控巨噬細(xì)胞TOLL樣受體的表達(dá)可能是該藥干預(yù)巨噬細(xì)胞吞噬功能和分泌炎癥因子的途徑之一;同時(shí)紫花地丁作為臨床抗感染和抗炎治療的常用中藥，其基于巨噬細(xì)胞的免疫和炎癥干預(yù)作用可能是該藥臨床療效的中藥機(jī)制。

在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，不同濃度的正常血清組巨噬細(xì)胞TLR-1～5的表達(dá)量存在差異，這可能是因血清中原有的TOLL樣受體調(diào)控物質(zhì)表現(xiàn)出的量效差異性;同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)不同濃度的含藥血清對巨噬細(xì)胞TLR-1～3的表達(dá)量呈現(xiàn)雙向調(diào)節(jié)作用，這反映了中藥成分及其藥理效應(yīng)的復(fù)雜性和多樣性，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步探索。

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