錢志英 劉亞潔 崔艷品 謝李寧 張順利

(河南師范大學生命科學學院省部共建細胞分化調(diào)控國家重點實驗室，新鄉(xiāng)453007)

水紅花子是蓼科植物紅蓼(Poiygonum orientale L.)的干燥成熟果實，廣泛生長于我國南北各省。水紅花子是重要的藥用資源，含有黃酮、脂肪油等多種化學成分，具有抗菌、抗腫瘤、免疫抑制、抗氧化等藥理作用［1，2］。本實驗室研究表明水紅花子對小鼠免疫功能及遲發(fā)型超敏反應(yīng)具有抑制效應(yīng)［3］。當細菌侵入機體后，其表面LPS可與巨噬細胞CD14相結(jié)合，進而激活巨噬細胞，而其產(chǎn)生的TNF-α是導致小鼠流產(chǎn)的重要效應(yīng)分子之一。CD204在巨噬細胞清除和滅活LPS過程中發(fā)揮重要作用［4］。本文旨在通過觀察水紅花子對LPS誘發(fā)流產(chǎn)小鼠子宮中巨噬細胞的功能特征變化，從免疫藥理學角度探討水紅花子的保胎效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 實驗藥品和器材 水紅花子(購自新鄉(xiāng)市益仁堂大藥房)，經(jīng)炮制后加蒸餾水浸泡12 h，水煎2次，合并濾液，蒸發(fā)濃縮至每ml含生藥1 g。LPS、固藍BB(均購自美國Sigma公司);α-醋酸萘酯(購自上海試劑一廠);山羊抗小鼠CD14多克隆抗體(購自Santa cruze公司);大鼠抗小鼠CD204單克隆抗體(購自英國Serotec Ltd公司);兔血清封閉液，生物素標記兔抗羊IgG、生物素標記兔抗大鼠IgG、辣根過氧化酶標記鏈酶卵白素、DAB酶底物顯色劑(均購自北京中山生物技術(shù)有限公司)。冰凍切片機(美國Reichert Histo公司);臺式高速低溫離心機(TGL-20M/B，湖南賽特湘儀器廠);酶標儀(ST-360，上?？迫A實驗系統(tǒng)有限公司)。

1.2 實驗動物 8周齡(體重20～22 g)的未經(jīng)產(chǎn)昆明系小鼠(清潔級Ⅱ)55只，常規(guī)飼養(yǎng)，自由取食飲水。1周后，眼觀檢查陰道涂片作發(fā)情期鑒定。若涂片經(jīng)姬姆薩染色，鏡下觀察全部為無核角質(zhì)化上皮細胞定為動情。動情期雌鼠與雄鼠1∶1合籠過夜，次日清晨檢出陰栓者定為孕0 d。

1.3 動物分組及處理 將昆明種小鼠隨機分為對照組(A組)和實驗組。實驗組又分為細菌脂多糖(LPS)處理組(B組)，水紅花子處理組(C組)，水紅花子及LPS雙處理組(D組)。A組:孕2 d開始灌生理鹽水，連續(xù)灌至8 d，其中在孕6 d注射生理鹽水;B組:孕2 d開始灌生理鹽水，連續(xù)灌至8 d，其中在孕6 d注射LPS(2 μg/g);C組:孕2 d開始灌水紅花子10 g/kg，連續(xù)灌至8 d，其中在孕6 d注射生理鹽水;D組:孕2 d開始灌水紅花子10 g/kg，連續(xù)灌至8 d，其中在孕6 d注射LPS(2 μg/g);所有小鼠均于孕9 d頸椎脫臼法處死，剖腹取出子宮，每只小鼠左側(cè)子宮角用于制備冰凍切片。右側(cè)子宮角用于ELISA檢測。

1.4 非特異性酯酶(α-NAE)染色 冰凍切片，橫切6 μm(每隔5片取一片)，用4℃純丙酮固定10 min，再用0.01 mol/L的PBS鹽溶液沖洗3次(5 min/次)，放入37℃非特異性酯酶染色孵育液中孵育40 min，然后經(jīng)0.01 mol/L的PBS鹽溶液沖洗3次(5 min/次)和雙蒸水浸泡5 min，最后甘油明膠封片。

1.5 免疫組化學染色 6 μm冰凍切片室溫晾30 min;4℃冷丙酮固定20 min;將切片置0.3%H2O2、10%正常兔血清封閉非特異性染色。然后分別滴加1∶100山羊抗小鼠CD14一抗，1∶100大鼠抗小鼠CD204一抗，于37℃孵育40 min后，依次滴加1∶300稀釋的生物素標記兔抗羊IgG、1∶600稀釋的生物素化的兔抗大鼠IgG和1∶400辣根過氧化酶標記鏈酶卵白素，于37℃孵育30 min;DAB顯色，鏡檢、照相。

1.6 子宮組織勻漿液制備和ELISA方法 將小鼠子宮置于預冷PBS中剪除多余的脂肪，縱向剖開子宮角，剝?nèi)ヅ咛?。?.75 μg/ml PMSF的PBS中冰浴勻漿，12 000 r/min、4℃離心 15 min，把上清液分裝，－20℃凍存。TNF-α檢測ELISA試劑盒按說明書操作，反應(yīng)后即刻在酶標儀450 nm處讀取OD值，由標準曲線計算各組樣品中TNF-α含量(pg/ml蛋白)。

1.7 細胞計數(shù)及數(shù)據(jù)分析 細胞計數(shù)于10×40倍光鏡下進行，每只動物取8張片子，對每張橫切切片隨機取6個視野觀察，用CIS圖像分析軟件測量免疫組化陽性細胞數(shù)量和陽性面積。所有數(shù)據(jù)以表示，統(tǒng)計學處理采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行單因素方差分析，兩兩比較及組間t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 水紅花子對小鼠胚胎發(fā)育的影響 B組全部發(fā)生流產(chǎn)，剖檢發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎死亡率100%、并開始融化，子宮淤血嚴重，胎盤結(jié)構(gòu)嚴重破壞，子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)為蛻膜化程度較低、上皮完整的修復狀態(tài)。而預先經(jīng)水紅花子處理后的D組僅有2只小鼠陰道有微量出血，并且出血時間分別較B組推遲16和20.5 h，胚胎吸收率10.39%。A組和C組小鼠無顯性流產(chǎn)現(xiàn)象，胚胎吸收率分別為3.7%和2.56%。胚胎呈粉紅色，胎膜及胎兒輪廓清晰，透光度好，無出血、淤血現(xiàn)象。見表1。

表1 水紅花子對LPS誘導小鼠流產(chǎn)的保護效應(yīng)Tab.1 Protective effects of fructus polygoni orientalis against LPS induced abortion in mice

2.2 水紅花子對小鼠子宮巨噬細胞的影響

2.2.1 水紅花子對子宮中α-NAE+巨噬細胞和α-NAE表達的影響 與A組相比，B組小鼠α-NAE+巨噬細胞數(shù)量和陽性面積在子宮組織各部位均明顯增多;D組雖然在環(huán)肌外側(cè)仍存在較多的細胞，但環(huán)肌內(nèi)側(cè)及功能層已接近A組(P＞0.05)，陽性面積已恢復正常。見表2。

表2 LPS和水紅花子對小鼠子宮α-NAE+巨噬細胞的影響()Tab.2 Effect of LPS and fructus polygoni orientalis on uterine α-NAE+macrophages of mice()

表2 LPS和水紅花子對小鼠子宮α-NAE+巨噬細胞的影響()Tab.2 Effect of LPS and fructus polygoni orientalis on uterine α-NAE+macrophages of mice()

Note:Ⅰ.Amount of macrophages;Ⅱ.Positive cell area.Compared with A group，1)P＜0.05;2)P＜0.01.

Groups Functional layerⅠⅡInside of myometriumⅠⅡOutside of myometriumⅠⅡA 1 4 23.2±3.67 1.83%±0.004 1 B 13.8±3.511) 3.31%± 0.007 92) 23.6±3.2922) 2.90%± 0.00402) 38.1±5.072) 1.39%±0.003 71)4.2±0.67 1.08%±0.001 1 8.4±1.35 0.96%± 0.00 C 1.76%±0.002 5 3.7±0.32 1.05% ± 0.001 2 9.2±0.61 0.91%±0.001 3 25.4±3.29 1.82%±0.003 4 D 4.9±0.45 1.05% ± 0.002 4 10.3±1.62 0.88%±0.001 8 27.6±3.981)

2.2.2 水紅花子對小鼠子宮CD14+巨噬細胞和CD14表達的影響 與A組相比，B組小鼠CD14+巨噬細胞數(shù)量和CD14免疫反應(yīng)陽性面積在子宮組織各部位均顯著增多;D組雖然在環(huán)肌外側(cè)仍存在較多的細胞，但環(huán)肌內(nèi)側(cè)及功能層已接近A組(P＞0.05)，功能層CD14免疫反應(yīng)陽性面積已恢復正常(P＞0.05)。見表3、圖1。

表3 LPS和水紅花子對小鼠子宮CD14+巨噬細胞的影響()Tab.3 Effect of LPS and fructus polygoni orientalis on uterine CD14+macrophages of mice()

表3 LPS和水紅花子對小鼠子宮CD14+巨噬細胞的影響()Tab.3 Effect of LPS and fructus polygoni orientalis on uterine CD14+macrophages of mice()

Note:Ⅰ.Amount of macrophages;Ⅱ.Positive cell area.Compared with A group，1)P＜0.05;2)P＜0.01.

Groups Functional layerⅠⅡInside of myometriumⅠⅡOutside of myometriumⅠⅡA 0 9 24.0±3.55 1.54%± 0.005 0 B 11.4±2.111) 3.92%±0.004 32) 21.2±2.301) 3.64%±0.003 72) 37.6±4.061) 4.04%± 0.004 52)3.6±0.47 1.25%±0.002 1 7.7±0.73 0.63%±0.00 4.1±0.53 1.12%±0.001 3 9.3±0.76 1.52%±0.001 41) 21.9±3.11 1.49%± 0.003 5 D 4.6±0.38 1.54%±0.003 3 8.8±0.41 1.51% ±0.002 21) 26.7±3.362) 2.64%± 0.004 21)C

2.2.3 水紅花子對小鼠子宮CD204+巨噬細胞和CD204表達的影響 與 A組相比，B組小鼠CD204+巨噬細胞數(shù)量及CD204免疫反應(yīng)陽性面積在環(huán)肌內(nèi)側(cè)、功能層無明顯變化，而環(huán)肌外側(cè)均顯著增多(P＜0.05);C組均顯著增多(P＜0.05);而D組環(huán)肌內(nèi)側(cè)、功能層均顯著增多(P＜0.05)，環(huán)肌外側(cè)極顯著增多(P＜0.01)。詳見表 4、圖 2。

表4 LPS和水紅花子對小鼠子宮CD204+巨噬細胞的影響()Tab.4 Effect of LPS and fructus polygoni orientalis on uterine CD204+macrophages of mice()

表4 LPS和水紅花子對小鼠子宮CD204+巨噬細胞的影響()Tab.4 Effect of LPS and fructus polygoni orientalis on uterine CD204+macrophages of mice()

Note:Ⅰ.Amount of macrophages;Ⅱ.Positive cell area.Compared with A group，1)P＜0.05;2)P＜0.01.

Groups Functional layerⅠⅡInside of myometriumⅠⅡOutside of myometriumⅠⅡA 0 4 23.1±3.69 1.07%± 0.003 9 B 4.4±0.47 0.32%±0.001 6 6.4±0.68 0.09%±0.000 4 9.4±2.661) 0.08%± 0.000 71)3.9±0.31 0.36%±0.002 5 5.9±0.76 0.13%±0.00 11.6±0.311) 1.19%±0.00131) 16.1±3.091) 0.34%±0.001 41) 33.8±3.031) 2.55%± 0.003 01)D 15.2±2.531) 1.65%±0.004 11) 15.7±4.121) 1.07%±0.003 61) 36.1±4.292) 3.76%± 0.004 02)C

2.3 水紅花子對小鼠子宮TNF-α含量的影響 與A組相比，B組小鼠子宮在LPS處理后TNF-α含量顯著升高(P＜0.05);與B組相比，D組TNF-α含量顯著降低，接近正常水平。見表5。

圖1 小鼠子宮CD14+巨噬細胞免疫組織化學染色Fig.1 Immunohistochemistry of CD14+macrophages in uterine of mice

圖2 小鼠子宮CD204+巨噬細胞免疫組織化學染色Fig.2 Immunohistochemistry of CD204+macrophages in uterine of mice

表5 LPS和水紅花子對小鼠子宮TNF-α含量的影響()Tab.5 Effect of LPS and fructus polygoni orientalis on TNF-α contents on uterine of mice()

表5 LPS和水紅花子對小鼠子宮TNF-α含量的影響()Tab.5 Effect of LPS and fructus polygoni orientalis on TNF-α contents on uterine of mice()

Note:Compared with A group，1)P＜0.05;Compared with B group，2)P＜0.01.

Groups TNF-α A 29.79±5.37 B 62.01±7.591)C 28.16±4.75 D 31.04±6.622)

3 討論

妊娠既是一個生理性的又是一個天然的免疫耐受過程，母-胎界面局部存在著復雜的免疫調(diào)控機制［5］，保證胎兒的正常分化發(fā)育和成熟。孕鼠在LPS的刺激下，巨噬細胞被孕酮抑制的細胞毒性作用可以恢復，起消滅微生物的防護作用［6］。巨噬細胞持續(xù)存在于整個妊娠期間的子宮和胎盤組織中，并且浸潤于胚胎種植區(qū)域，說明功能層組織巨噬細胞可能是一種與妊娠相關(guān)的重要的功能細胞［7］。為了更好地反映出巨噬細胞在子宮組織中的分布變化與小鼠胚胎丟失之間的關(guān)系，本文將子宮組織結(jié)構(gòu)以環(huán)肌為界，分為環(huán)肌外側(cè)、環(huán)肌內(nèi)側(cè)及功能層三部分，分別統(tǒng)計巨噬細胞的數(shù)量變化及相應(yīng)膜分子的表達變化。結(jié)果顯示，與A組相比，B組小鼠子宮環(huán)肌外側(cè)、環(huán)肌內(nèi)側(cè)及功能層α-NAE+、CD14+巨噬細胞數(shù)量均顯著增加，α-NAE活性增強，CD14的表達上調(diào)，TNF-α含量急劇增加(P＜0.01)，并且在功能層處有大量α-NAE+、CD14+巨噬細胞浸潤，而小鼠流產(chǎn)率和胚胎丟失率均達到100%。有資料證實，LPS可誘發(fā)大鼠和小鼠的胚胎吸收［8］，然而LPS并不干擾孕鼠的正常內(nèi)分泌功能，也不能穿越胎盤進入胎兒體內(nèi);LPS誘導流產(chǎn)的一個重要機制是引起預致敏(Primed)的巨噬細胞釋放TNF-α［9］。說明子宮巨噬細胞增多、TNF-α含量升高，對胚胎存活是有害的。由此可見，LPS可促進α-NAE+巨噬細胞從系膜側(cè)向子宮內(nèi)膜及胎盤處的遷移、聚集，促使其分泌大量的TNF-α等細胞炎性因子，并最終導致流產(chǎn)，提示這可能是對胚胎的一種排斥機制。同時也注意到，CD14+巨噬細胞的數(shù)目要少于α-NAE+巨噬細胞的數(shù)目，這可能是用CD14顯示巨噬細胞的靈敏度不及非特異性酯酶高的緣故。本實驗室曾報道小鼠胚胎著床和維持與子宮巨噬細胞的分布變化有關(guān)［10］，本文則進一步從巨噬細胞模式識別受體CD14的變化證明了其功能活性改變與小鼠胚胎丟失之間的關(guān)系。從D組結(jié)果可見，與B組相比，水紅花子可以減少子宮α-NAE+、CD14+巨噬細胞的數(shù)量，降低TNF-α的含量，同時明顯降低LPS導致的流產(chǎn)率;與A組相比，環(huán)肌外側(cè)雖然仍有較多的巨噬細胞分布，但靠近胚胎的子宮功能層和胚胎著床處幾乎未見巨噬細胞的存在，表明水紅花子能夠阻止巨噬細胞從系膜側(cè)向子宮內(nèi)膜及胎盤處的遷移。綜上所述，水紅花子的抗LPS流產(chǎn)作用可能與阻止巨噬細胞從環(huán)肌外側(cè)向功能層的遷移、減弱其免疫識別功能以及抑制TNF-α的分泌有關(guān)。

巨噬細胞是誘導免疫應(yīng)答的主要細胞，分為M1和M2［11-13］。M1細胞即為經(jīng)典活化型巨噬細胞(Classical activated macrophage，CAM)，M2 細胞是一群具有抗炎作用的異質(zhì)性巨噬細胞，包括:替代活化型巨噬細胞(Alternatively activated macrophage，AAM)，其能表達 CD204;Ⅱ型活化的巨噬細胞(Type2-activated macrophage)，能表達 IL-10，具有抗炎癥并參與 Th2型免疫應(yīng)答的作用［14］。Chaouat等［15］發(fā)現(xiàn)流產(chǎn)小鼠胎盤中 IL-10 含量低，IFN-γ、TNF-α含量高;而非特異性免疫可提高小鼠胎盤IL-10含量和胚胎成活率，說明Th2細胞因子IL-10對正常妊娠的維持具有保護作用。推測Ⅱ型活化的巨噬細胞對保護胎兒免受母體免疫系統(tǒng)攻擊具有重要作用。因此，本文重點觀察了水紅花子對小鼠子宮CD204+巨噬細胞的影響。結(jié)果顯示，經(jīng)水紅花子處理之后的C組和D組小鼠，子宮中均分布著較多的CD204+巨噬細胞(P＜0.05)，提示水紅花子可以促進巨噬細胞的非經(jīng)典活化，與之相對應(yīng)的是，D組小鼠的流產(chǎn)率及胚胎丟失率均顯著降低。因而推測M2巨噬細胞可以保護胚胎免受母體免疫系統(tǒng)的攻擊，以此對抗LPS激發(fā)的流產(chǎn)效應(yīng)可能是水紅花子保胎作用的機制之一。

本文通過研究水紅花子對巨噬細胞表型、活性及功能的影響，從免疫學角度探討了其可能具有的保胎作用及其機制，為中藥免疫治療流產(chǎn)提供了有價值的實驗資料。但是，關(guān)于水紅花子的有效成分及其作用的分子機制仍需進行更加深入全面的研究，為其作為新型免疫抑制劑的應(yīng)用提供更詳實的實驗依據(jù)。

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