鄭曉文 陳一強 孔晉亮 張劍鋒 經(jīng)慶玲(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸病研究所，南寧 530021)

肺癌發(fā)病率已居人類腫瘤首位，是腫瘤死亡的首要原因，化學(xué)治療仍是目前主要治療手段之一。傳統(tǒng)化療藥物毒副作用大、易產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致治療效果差。肉桂醛(Cinnamic aldehyde，CNMA)是一種FDA批準的常用食物香精的添加劑，有抗腫瘤、抗真菌、抗病毒作用，具有來源廣泛、價廉、低毒副作用等優(yōu)點［1］。已有多項研究表明小劑量肉桂醛在體外即可誘導(dǎo)細胞凋亡，直接抑制人黑色素瘤細胞、人肝癌細胞、結(jié)腸癌細胞等的增殖［2-4］。我們的前期實驗發(fā)現(xiàn)小劑量肉桂醛作用肺腺癌A549細胞后其異常表達E-cadherin與MMP-9，并表現(xiàn)出增強的細胞遷移能力。Hedgehog信號通路是細胞分化增殖、組織分極的一種主要調(diào)節(jié)因子，Chen等［5］發(fā)現(xiàn)在肝癌細胞中 Hedgehog信號通路通過激活 MMP-2、MMP-9誘導(dǎo)腫瘤細胞的遷移和侵襲。本研究以不同濃度的肉桂醛作用于人肺腺癌A549細胞，并通過環(huán)巴胺阻斷Hedgehog信號通路，探討肉桂醛是否通過激活Hedgehog信號通路影響肺腺癌A549細胞的E-cadherin、MMP-9的表達，異常激活的Hedgehog信號通路是否與肉桂醛耐藥性的形成密切相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料及相關(guān)試劑配制 人肺腺癌A549細胞株、人支氣管上皮HBE細胞(中國科學(xué)院上海細胞庫)，人E-cadherin及人MMP-9 ELISA試劑盒(武漢博士德生物公司);RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone公司);肉桂醛、環(huán)巴胺及MTT(Sigma公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物);定量PCR試劑盒(Roche);E-cadherin單克隆抗體(Immunoway，YM0208);MMP-9單克隆抗體(Immunoway，YM0447)。原裝肉桂醛溶液用DMSO溶解成濃度為1.048 g/ml的母液，用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋成200 μg/ml，按實驗要求稀釋成不同濃度。環(huán)巴胺(Cyclopamine)用DMSO配成20 nmol/ml，使用時用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋成不同的濃度。

1.1.2 Realtime-PCR引物序列 在NCBI gene bank查到相應(yīng)的基因序列，采用Oligo5.0進行引物設(shè)計，然后在NCBI上進行primer blast，采用評分最高的引物序列。引物序列的合成由北京六合華大基因公司合成。見表1。

表1 引物序列及產(chǎn)物長度Tab.1 Primer sequences and products size

1.2 方法

1.2.1 MTT法測定肉桂醛及環(huán)巴胺對A549細胞增殖的影響 對數(shù)生長期A549細胞，0.25%胰酶消化，血清終止細胞消化，1 000 r/min離心5 min，細胞計數(shù)后，2.5×104ml－1的密度接種于 96 孔板，每孔加入200 μl，置入37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)。待細胞貼壁后分別加入 0、10、20、40 μg/ml的肉桂醛或0、1、2、5 nmol/ml的環(huán)巴胺。每組5 個復(fù)孔，置入孵箱繼續(xù)培養(yǎng)，至24、48、72 h時，每孔分別加入5 mg/ml的 MTT溶液20 μl，繼續(xù)孵箱培育4 h，吸盡上液后，每孔加入二甲基亞砜150 μl，避光振蕩約10 min，酶標儀490 nm處測量吸光度OD值。

1.2.2 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力 對數(shù)生長期的A549細胞以104ml－1的密度接種于6孔板，待細胞貼壁長滿后，加入含20 μg/ml肉桂醛培養(yǎng)基，定期換液，待細胞長滿后，用200 μl無菌槍頭在孔底劃線，用PBS沖去脫落的細胞，加入無血清培養(yǎng)基，分別在0、24 h拍照，用Image-pro plus測量細胞遷移的距離。

1.2.3 ELISA法測定細胞培養(yǎng)上清液中分泌性E-cadherin和 MMP-9的量 將 A549以104ml－1的密度接種于24孔板，貼壁后加或不加2 nmol/ml環(huán)巴胺，作用24 h 后棄上清，分別加入 0、10、20、40 μg/ml的肉桂醛溶液，均設(shè)5個復(fù)孔，在培養(yǎng)24、48、72 h后分別吸取培養(yǎng)基，分為空白組、環(huán)巴胺組、肉桂醛組、肉桂醛+環(huán)巴胺組，1 000 r/min離心5 min后取上清，－20℃保存。按ELISA試劑盒說明書稀釋標準品，均設(shè)8個濃度梯度，并解凍保存的上清液樣本至室溫，按說明書進行操作，反應(yīng)后酶標儀450 nm波長處測量吸光度OD值。

1.2.4 熒光定量PCR檢測A549中Hedgehog信號通路主要成份及E-cadherin、MMP-9的mRNA水平的表達 熒光定量PCR檢測人HBE和A549細胞中Hedgehog信號通路主要成份的表達 分為HBE組、A549 組、A549+肉桂醛(20 μg/ml)三組，檢測 20 μg/ml肉桂醛作用前后的A549細胞和HBE細胞的SHH、PTCH1、SMO、GLI1 mRNA 表達。提取細胞總RNA，電泳判斷總RNA的完整性，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，進行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系20 μl［(Mix 10 μl，上游引物(10 μmol/L)0.6 μl，下游引物(10 μmol/L)0.6 μl，cDNA 1 μl，雙蒸水 7.8 μl］。反應(yīng)條件95℃ 10 min;95℃ 15 s，60℃ 1 min(40個循環(huán))。60℃收集熒光。軟件生成的標準曲線R2均大于0.99，擴增效率為90%～110%。按以上體系以及條件分別測定待測樣本目的基因及內(nèi)參的Ct值，2－△△Ct法計算基因表達的差異［注:2－△△Ct公式中:△△Ct=(Ct目的－Ct內(nèi)參)待測樣本－(Ct目的－Ct內(nèi)參)參照樣本］。

A549 E-cadherin和MMP-9的mRNA水平表達分為空白組，環(huán)巴胺組(2 nmol/ml)，肉桂醛組(20 μg/ml)，環(huán)巴胺+肉桂醛組(2 nmol/ml+20 μg/ml)，分別作用 A549細胞24、48 h。其具體檢測方法同上。

1.2.5 蛋白免疫印跡法檢測A549中E-cadherin、MMP-9蛋白的表達 常規(guī)提取20 μg/ml肉桂醛和/或2 nmol/ml環(huán)巴胺作用24 h的A549細胞總蛋白，SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜 90 min，5%脫脂奶粉封閉 1 h，1∶5 000鼠抗人E-cadherin和1∶5 000兔抗人MMP-9室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，1∶6 000二抗孵育55 min，TBST洗膜3次，ECL顯色，以β-actin作為內(nèi)參照，用Quantity one圖像分析軟件進行灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS16.0統(tǒng)計，計量資料以表示，組與組之間比較采用t檢驗，P＜0.05被認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肉桂醛及環(huán)巴胺對A549細胞增殖的影響 10 μg/ml肉桂醛作用于A549細胞24 h時即可產(chǎn)生明顯的抑制作用，隨著濃度的增大抑制作用增大，不同濃度組之間以及各濃度組與對照組之間的抑制強度均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。隨著作用時間增長，A549細胞增殖活性持續(xù)性降低，40 μg/ml的肉桂醛作用72 h后產(chǎn)生的增殖抑制率最高，為(93.782±5.036)%。環(huán)巴胺抑制A549的增殖，隨著其濃度的增加，作用時間窗的延長，抑制的強度呈上升趨勢，5 nmol/ml作用72 h抑制率為(40.539±4.923)%，不同濃度組之間以及各濃度組與對照組之間的抑制強度差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。增殖抑制率=(1－實驗組OD值/對照組OD組)×100%。見表2、3。

表2 肉桂醛對A549細胞增殖的抑制率(%，)Tab.2 Inhibition rate of Cinnamic aldehyde on proliferation in A549 cell(%，)

表2 肉桂醛對A549細胞增殖的抑制率(%，)Tab.2 Inhibition rate of Cinnamic aldehyde on proliferation in A549 cell(%，)

Note:1)P＜0.01，compared to 0 μg/ml group;2)P＜0.01，compared to 10 μg/ml group;3)P＜0.01，compared to 20 μg/ml group.

Concentration(μg/ml)24 h 48 h 72 h 0 0 0 0 10 23.133±3.3971) 30.142±4.2481) 40.324±3.6231)20 45.307±5.1221)2) 52.097±4.7921)2) 60.031±5.7831)2)40 57.073±4.2431)2)3)79.098±6.2131)2)3)93.782±5.0361)2)3)

表3 環(huán)巴胺對A549細胞增殖的抑制率(%，)Tab.3 Inhibition rate of Cyclopamine on proliferation in A549 cell(%，)

表3 環(huán)巴胺對A549細胞增殖的抑制率(%，)Tab.3 Inhibition rate of Cyclopamine on proliferation in A549 cell(%，)

Note:1)P＜0.01，compared to 0 nmol/ml group;2)P＜0.01，compared to 1 nmol/ml group;3)P＜0.01，compared to 2 nmol/ml group.

Concentration(nmol/ml)24 h 48 h 72 h 0 0 0 0 1 11.627±2.4731) 18.647±2.5581) 21.471±3.1221)2 25.581±3.3671)2) 27.275±3.1651)2) 30.258±4.3651)2)5 34.883±3.8521)2)3)36.294±4.6371)2)3)40.539±3.9231)2)3)

2.2 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力 經(jīng)20 μg/ml肉桂醛作用后的A549細胞較空白組明顯橫向遷移能力增加(見圖1)。空白組24 h相對遷移距離為38.523±16.627，肉桂醛組的相對遷移距離為164.121±43.294，二者移動的距離具有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.000 3)。

2.3 肉桂醛對A549細胞分泌性E-cadherin和MMP-9的表達的影響

2.3.1 肉桂醛對A549細胞分泌性E-cadherin表達的影響 不同濃度的肉桂醛作用于 A549，10、20、40 μg/ml的濃度均可以導(dǎo)致 E-cadherin的分泌呈下降 趨勢，40μg/ml在72h分泌E-cadherin最少，為887.452 pg/ml，不同的濃度組24、48和72 h的 E-cadherin分泌量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，表4)。與空白組相比較，E-cadherin的分泌量在環(huán)巴胺組增多，在肉桂醛組則是分泌量減少，環(huán)巴胺和肉桂醛聯(lián)合組分泌量增多，分泌量的差異在各組之間相比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);在24、48、72 h三個時間呈現(xiàn)同一趨勢(圖2A)。

2.3.2 肉桂醛對A549細胞分泌性MMP-9表達的影響 肉桂醛作用于 A549，10、20、40 μg/ml組均導(dǎo)致MMP-9的分泌量上升，40 μg/ml在72 h分泌MMP-9最多，為1 863.470 pg/ml，不同的濃度組在各個時間的MMP-9的分泌量相比較均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05，表4)。與空白組相比較，MMP-9的分泌在環(huán)巴胺組減少，肉桂醛組則是分泌增加，二者聯(lián)合后分泌減少，分泌量的差異在各組之間相比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);在24、48、72 h三個時間呈現(xiàn)同一趨勢(圖2)。

2.4 Hedgehog信號通路主要成份在A549中的表達 Hedgehog信號通路4種主要成份SHH、PTCH1、SMO、GLI1的mRNA相對表達量在A549中的表達明顯高于HBE細胞，20 μg/ml肉桂醛作用后A549的各成份mRNA相對表達量增加，HBE、A549及肉桂醛組的各成份mRNA表達均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。見圖3。

2.5 肉桂醛作用A549細胞后E-cadherin和MMP-9的mRNA的相對表達量的變化 環(huán)巴胺組及環(huán)巴胺+肉桂醛組的E-cadherin mRNA表達與空白組相比較均呈上升趨勢，而肉桂醛組呈下降趨勢。肉桂醛組的E-cadherin mRNA表達高于聯(lián)合組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。各組E-cadherin mRNA 24 h與48 h的表達量無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。見圖4A。

MMP-9 mRNA的表達在環(huán)巴胺組呈下降趨勢，在肉桂醛及聯(lián)合組呈現(xiàn)上升趨勢，環(huán)巴胺組相對表達量最高，與其余各組差異顯著(P＜0.05)，聯(lián)合組的表達明顯高于肉桂醛組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。各組MMP-9 mRNA的相對表達24 h與48 h之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)見圖4B。肉桂醛組的E-Cadherin和MMP-9的mRNA的相對表達量24 h相關(guān)系數(shù)R2=－0.995 5，48 h相關(guān)系數(shù)R2=－0.977。

2.6 蛋白免疫印跡法檢測A549細胞E-cadherin和MMP-9蛋白水平表達 肉桂醛作用A549細胞后E-cadherin蛋白水平表達量相對減少，而作用于已被環(huán)巴胺預(yù)處理的A549細胞，其E-cadherin蛋白相對表達量與肉桂醛組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.019 7)。MMP-9蛋白的相對表達量在肉桂醛組最高，環(huán)巴胺+肉桂醛組最低，二者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001 4)。見圖5。

圖1 肉桂醛對A549細胞遷移的影響(×200)Fig.1 Effect of Cinnamic aldehyde on A549 cell migration(×200)

表4 肉桂醛作用于A549后分泌性E-cadherin和MMP-9的表達Tab.4 Expression of E-cadherin and MMP-9 on A549 with Cinnamic aldehyde detected by ELISA

圖2 ELISA檢測E-cadherin和MMP-9在不同組中表達Fig.2 E-cadherin and MMP-9 expression in different groups detected by ELISA

圖4 肉桂醛對A549的E-cadherin和MMP-9 mRNA表達的影響Fig.4 E-cadherin and MMP-9 mRNA expression on A549 co-cultured with Cinnamic aldehyde

3 討論

圖3 Hedgehog信號通路成份在不同組中的mRNA表達Fig.3 mRNA expression of Hedgehog signal transduction pathway members on different groups

圖5 肉桂醛對A549細胞E-cadherin和MMP-9蛋白水平表達的影響Fig.5 Expression of E-cadherin and MMP-9 protein in A549 co-cultured with Cinnamic aldehyde

肺癌是一種嚴重威脅人類健康的疾病。腫瘤藥物生物綜合治療中的耐藥形成會造成腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，降低治療的有效性。如何提高目前腫瘤藥物治療的特異性，減少機體不良反應(yīng)，避免耐藥性的形成等仍是腫瘤生物綜合治療的研究重點。尋找新的安全有效的可替代傳統(tǒng)藥物的化療藥物也一直是研究熱點。

本研究發(fā)現(xiàn)小劑量的肉桂醛即可以明顯抑制細胞的增殖，并且隨著濃度的增大、作用時間的延長，抑制率隨之增加。已有多項研究表明小劑量肉桂醛在體外即可誘導(dǎo)細胞凋亡，直接抑制人黑色素瘤細胞、人肝癌細胞、結(jié)腸癌細胞等的增殖，而達到抗腫瘤的作用。有關(guān)肉桂醛抗腫瘤的具體機制的相關(guān)研究表明:肉桂醛可以誘導(dǎo)人肝癌PLC/PRF/5細胞凋亡，其靶向凋亡主要通過線粒體途徑，用維生素E預(yù)處理細胞可以顯著抑制肉桂醛介導(dǎo)的凋亡，該機制可能與 XIAP、cIAP-1、cIAP-2、Bcl-2 和 Bax蛋白活性調(diào)節(jié)相關(guān)［4］。Toshio 等［6］發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因小鼠CB6F1-TgHras2(rasH2)的致癌性實驗中，服用肉桂醛后在雄性小鼠中可顯著減少甲基亞硝氨基吡啶NNK誘發(fā)的肺腫瘤的發(fā)生率和降低腫瘤的基因多態(tài)性。Audrey等［2］發(fā)現(xiàn)用最小毒性濃度的肉桂醛作用于結(jié)腸癌HCT細胞4～6 h即可以誘導(dǎo)明顯的DNA損害，并削弱 DNA修復(fù)重組，減少自發(fā)性突變。

肉桂醛抗腫瘤的作用是非常明確的，但目前尚未有關(guān)于肉桂醛耐藥的報道。本實驗結(jié)果顯示在細胞劃痕實驗中，肉桂醛作用后的細胞表現(xiàn)出較強的遷移能力，并且在細胞水平伴隨E-cadherin表達的減低和 MMP-9表達的上升，提示肉桂醛作用于A549細胞后，引起細胞適應(yīng)性變化，異常表達某些基因或某些通路的異常表達，導(dǎo)致增強的遷移、侵襲能力。這是不是提示肉桂醛短時間作用下細胞會產(chǎn)生適應(yīng)性的變化，來抵抗機體的腫瘤免疫清除作用?如果在肉桂醛作用下A549細胞產(chǎn)生了適應(yīng)性的變化，又是通過何種途徑來實現(xiàn)的呢?既往研究表明，腫瘤的遷移和侵襲過程中E-cadherin和MMPs中發(fā)揮重要的作用，多種調(diào)控機制參與這個過程。E-cadherin是一種重要的阻止腫瘤細胞離開原發(fā)病灶的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子［7］。在人肺腺癌細胞系A(chǔ)549中，通過下調(diào) E-鈣黏素并且上調(diào)纖維連接蛋白、MMP-2、連接組織生長子和膠原，誘導(dǎo)EMT，使得細胞-細胞接觸減少，最終導(dǎo)致細胞的延伸［8］。激素非依賴的PC-3細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達WIF-1導(dǎo)致更多的細胞間連接形成的形態(tài)學(xué)改變，顯示弱侵襲的腫瘤表型，這種形態(tài)學(xué)的改變伴隨著顯著減少的E-cadherin表達［9］。E-cadherin的表達上調(diào)、MMP-2 和MMP-9的活性和表達下調(diào)抑制雄激素非依賴的PC-3細胞的體外侵襲和腫瘤生長［9］。

Hedgehog(Hh)信號通路調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化，并在胚胎發(fā)育期起關(guān)鍵作用，協(xié)調(diào)組織器官如皮膚、腦、神經(jīng)管、腸及肺等發(fā)育過程中的關(guān)鍵步驟，在成年期，調(diào)節(jié)干細胞及早期祖細胞微環(huán)境［10］。SHH還影響細胞的命運，促進其增殖、抑制神經(jīng)細胞的分化和調(diào)控血管直徑加粗、變長和分叉，影響基質(zhì)細胞分泌眾多新生血管因子［11］。致病性HH活動已在多種人腫瘤中被描述，包括胰腺癌、結(jié)腸癌、轉(zhuǎn)移性前列腺癌和膠質(zhì)母細胞瘤、惡性黑色素瘤［12-15］。本研究表明 Hedgehog信號通路主要成份 SHH、PTCH1、SMO、GLI1在A549細胞中的表達明顯高于肺上皮細胞HBE，肉桂醛作用前后的A549細胞的Hedgehog信號通路各成份的表達具有統(tǒng)計學(xué)差異，提示肺腺癌A549細胞中有異常激活的Hedgehog信號通路，而肉桂醛的作用可進一步刺激其信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)。當(dāng)使用Hedgehog信號通路抑制劑環(huán)巴胺，在1 nmol/ml即可以逆轉(zhuǎn)肉桂醛導(dǎo)致的E-cadherin表達下調(diào)及MMP-9表達增高，表現(xiàn)為E-cadherin表達上調(diào)及 MMP-9表達下調(diào)，表明肉桂醛可能通過Hedgehog信號通路的異常激活來調(diào)控E-cadherin和MMP-9的表達，并且這種激活是濃度依賴式的。

我們的研究表明，肉桂醛直接抑制人肺腺癌A549細胞，但小劑量肉桂醛作用A549細胞后，細胞表現(xiàn)出增加的遷移能力，E-cadherin表達下調(diào)及MMP-9表達增高，與異常激活的Hedgehog信號通路相關(guān)。與既往腫瘤化療藥物治療中出現(xiàn)的情形一致，腫瘤細胞化療藥物作用后產(chǎn)生了一些適應(yīng)性的變化或者是腫瘤細胞中一些具有更強抗藥性的細胞殘存了下來，是不是驗證了所謂“腫瘤起始細胞”或稱之為腫瘤干細胞的存在?而后者常常是腫瘤轉(zhuǎn)移和治療后復(fù)發(fā)的根源所在［16］。肉桂醛有明確的抗腫瘤作用，但是小劑量短時間即可使A549細胞產(chǎn)生了一定的耐藥性，表現(xiàn)為E-cadherin表達下調(diào)及MMP-9表達增高，異常激活的Hedgehog信號通路可能是其主要原因之一。

綜上，肉桂醛可以聯(lián)合Hedgehog信號通路抑制劑治療人類肺腺癌獲得良好的治療效果，但探索適宜的作用濃度、最佳作用時間，聯(lián)合特定生物靶向劑，提高治療的特異性，減少耐藥性的形成等仍是研究肉桂醛抗腫瘤機制的重點方向。

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