穆柳青 李岱容 張春燕 樊 宇 何永林 楊 春

(重慶醫(yī)科大學分子醫(yī)學與腫瘤研究中心，重慶 400016)

結核病(Tuberculosis，TB)是由MTB引起的一種世界性傳染病，也是當今世界由單一致病菌感染導致死亡率最高的感染性疾?。?］。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)統(tǒng)計，全球大約有1/3人口有潛伏期結核分枝桿菌的感染，每年約有870萬新發(fā)病例，140萬人因結核病死亡［2］。隨著人口數(shù)量的增長、HIV感染以及多重耐藥菌株的出現(xiàn)，全球范圍內結核病的發(fā)病人數(shù)再次上升。有效地控制結核病的發(fā)展和傳播已刻不容緩。因此尋找穩(wěn)定、高效的檢測方法和研發(fā)有效的疫苗成為當今防治結核病的工作重點。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，大部分原核生物擁有ATP依賴的絲氨酸蛋白酶系統(tǒng)，例如Lon和Clp蛋白酶［3］，Clp蛋白酶參與調節(jié)生物體蛋白質代謝，清除不可逆損傷蛋白質、對外應激耐受及維持內環(huán)境穩(wěn)態(tài)，在細菌的生長與致病過程中起重要作用。ClpC2是結核分枝桿菌Clp蛋白酶的調節(jié)亞基，也是潛在的抗結核藥物的靶標。

本實驗通過表達純化ClpC2蛋白，并制備相應多克隆抗體，為后續(xù)深入研究兔抗ClpC2多克隆抗體的生物功能、驗證ClpC2作為診斷靶標、藥靶候選蛋白的可行性提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質粒 大腸桿菌BL21(DE3);BCG和質粒表達載體pET32a(+)均為重慶醫(yī)科大學神經(jīng)感染性疾病實驗室保存;重組質粒pET32a(+)-ClpC2為重慶醫(yī)科大學神經(jīng)感染性疾病實驗室構建。

1.1.2 主要試劑 氨芐青霉素(Ampicillin Na)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(鼎國昌盛生物技術有限責任公司，北京);SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(碧云天生物技術研究所，上海);弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑(Sigma公司，美國);蛋白分子量標準(Fermentas公司，德國);Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒(康為世紀生物科技有限公司，北京);HRP標記的山羊抗小鼠IgG、HRP標記的山羊抗兔IgG、HRP標記的山羊抗人IgG、DAB顯色試劑盒(中杉金橋生物技術有限公司，北京);MTB H37Rv感染的小鼠血清為重慶醫(yī)科大學神經(jīng)感染性疾病實驗室保存;健康雄性新西蘭大白兔購自重慶醫(yī)科大學實驗動物中心;正常人血清、結核病人血清來自重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院呼吸科。

1.2 方法

1.2.1 rClpC2的誘導表達 將測序正確的重組質粒pET32a(+)-ClpC2轉化大腸桿菌BL21(DE3)，挑取陽性克隆菌接種于3 ml含氨芐青霉素(100 μg/ml)的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩13 h;取3 ml菌液接種于500 ml含氨芐青霉素(100 μg/ml)的LB培養(yǎng)液中，37℃快速振蕩培養(yǎng)3 h;加入IPTG使其終濃度為1 mmol/ml，37℃ 振蕩誘導 3 h，進行 12%SDSPAGE分析;將誘導重組表達菌離心收集菌體，以5 g/ml濕菌的比例加入超聲緩沖液，冰浴中超聲碎菌(功率3 00 W，超聲3 s，間隔 3 s，共30 min);4℃離心，分別收集上清和沉淀(包涵體)，SDS-PAGE分析重組蛋白表達形式。

1.2.2 rClpC2的 Western blot鑒定 rClpC2經(jīng)12%SDS-PAGE后，電轉移至PVDF膜上，封閉液封閉2 h，分別加入MTB H37Rv株感染的小鼠血清(1∶50)稀釋;4℃孵育過夜;PBST洗滌，加入HRP標記的山羊抗小鼠IgG(1∶5 000稀釋);室溫作用1 h，DAB顯色觀察結果。

1.2.3 rClpC2的純化 將細菌裂解液上清經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后負載上Ni-Agarose His柱，按照Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒進行蛋白純化，對收集液進行SDS-PAGE鑒定;按照BCA蛋白定量試劑盒對收集的蛋白溶液進行濃度測定;通過Bandscan分析rClpC2的表達量及純度。

1.2.4 兔抗血清的制備 新西蘭大白兔免疫前取耳緣靜脈血2 ml，分離血清置于－80℃保存?zhèn)溆?。將純化的rClpC2與等體積弗氏完全佐劑經(jīng)研磨充分乳化;分別在白兔脊背，左右腳足墊，左右腹股溝皮下注射乳化液，注射量2 ml/只，每只抗原免疫用量1.0 mg。3周后進行首次加強免疫，2周后用同樣的方法加強免疫，以后每隔1周加強免疫1次，共免疫5次，其中第二、三次加弗式不完全佐劑，第四次免疫后于兔耳緣靜脈采血，通過瓊脂糖雙擴法檢測特異性抗體的效價;第五次加強免疫7 d后，對白兔進行心臟取血40 ml，全血置37℃1 h，4℃過夜，收集血清，分裝置于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 兔抗血清特異性的鑒定 BCG經(jīng)超聲碎菌后的混合液經(jīng)12%SDS-PAGE后，電轉移至PVDF膜上，封閉液封閉2 h，加入兔抗rClpC2血清(1∶100稀釋)，4℃孵育過夜;PBST洗滌，加入HRP標記的山羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)，室溫作用1 h，DAB顯色觀察結果。

1.2.6 兔抗血清效價的測定 通過雙向免疫擴散法測定血清效價。以生理鹽水配置含1%瓊脂糖、1%PEG6000的溶膠，加熱融化澆注于潔凈的載玻片上，每張載玻片約3～5 ml;待瓊脂凝固后打孔形成梅花形。將待測抗體于1∶2～1∶128稀釋，順時針方向加入周圍孔中，抗原原液1∶2稀釋后加入中間孔，每孔約10 μl。放置于濕盒37℃作用24 h后觀察結果。

1.2.7 間接ELISA法檢測兔抗血清效價 用碳酸鹽緩沖液將重組蛋白ClpC2溶解并調整濃度為10 μg/ml;在96孔酶聯(lián)板中加入上述包被液，每孔100 μl;將酶聯(lián)板置于濕盒中，4℃過夜;次日，棄包被液，PBS洗滌3次;加封閉液，每孔 300 μl，37℃放置 2 h;棄去封閉液，PBST洗滌3次;加入倍比稀釋的第五次免疫1周后采集的兔血清，每孔100 μl，37℃放置2 h;棄去稀釋的兔抗血清，PBST洗滌4次，每次間隔3 min;加入1∶5 000稀釋的羊抗兔IgG-HRP，每孔100 μl，37℃ 孵育 1 h;棄去抗體，PBST 洗滌 4次，每次間隔3 min;加入顯色液 TMB，每孔100 μl，37℃孵育15 min;每孔加入50 μl終止液顯色，在450 nm波長出測吸光度值OD450?？贵w滴度定義為:OD樣品與OD陰性之比大于或等于2.1時最大的血清稀釋倍數(shù)。

1.2.8 間接ELISA法檢測ClpC2蛋白的抗原性rClpC2包被96孔酶聯(lián)板，濃度為10 μg/ml;每孔100 μl。用間接ELISA法對結核陽性、陰性血清進行測定，在450 nm波長處測吸光度值OD450。陰性對照血清標本的平均OD值加上2倍標準方差(Standard deviation，SD)作為判斷標準，若病人血清標本OD值大于此標準，即判斷為陽性，反之則為陰性。據(jù)此評價抗原的反應活性。

1.2.9 間接ELISA檢測TB血清中ClpC2抗原將健康人血清、肺結核病人血清1∶100稀釋，包被96孔酶聯(lián)板，每孔100 μl;兔抗血清 1∶100稀釋作為一抗。間接ELISA法對結核陽性、陰性血清進行測定，在450 nm波長處測吸光度值OD450。陰性對照血清標本的平均OD值加上2倍標準方差(Standard deviation，SD)作為判斷標準，若病人血清標本OD值大于此標準，即判斷為陽性，反之則為陰性。據(jù)此評價兔抗血清檢測肺結核病人的敏感性和特異性。

2 結果

2.1 rClpC2表達形式的分析 SDS-PAGE分析顯示，含有pET32a(+)空質粒的表達菌BL21(DE3)經(jīng)誘導后表達蛋白相對分子量大小為20 kD的Trx(硫氧還原蛋白)，含有 pET32a(+)-ClpC2的表達菌BL21(DE3)經(jīng)誘導后表達的蛋白相對分子量約為46 kD，與Trx-ClpC2(相對分子量26.7 kD)融合蛋白的相對分子量大小相符;rClpC2以可溶性和不可溶性兩種形式存在，但主要以可溶性的形式存在于上清液中;見圖1。

圖1 rClpC2表達形式的分析Fig.1 Analysis of rClpC2 expression form

2.2 rClpC2的 Western blot鑒定 Western blot 分析顯示，rClpC2可與MTB H37Rv感染的小鼠血清發(fā)生抗原抗體反應，在相對分子質量46 kD處可見明顯條帶，見圖2。

2.3 純化蛋白的鑒定及濃度測定 細菌裂解液上清經(jīng)Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒進行蛋白純化，純化后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析，在相對分子質量46 kD處可見一特異條帶，與目的蛋白ClpC2大小相符，見圖1;經(jīng)Bandscan分析rClpC2約占菌體總蛋白的 58.7%，純化后 rClpC2的純度為88.5%;通過 BCA法測得純化蛋白濃度為1.0 mg/ml。

2.4 兔抗血清的Western blot鑒定 Western blot分析顯示，兔抗血清可與BCG中ClpC2蛋白反應，在相對分子質量26 kD處可見明顯條帶，見圖3。

2.5 兔抗血清效價的測定 免疫擴散24 h后，分別在稀釋2、4、8、16、32倍的血清與抗原之間出現(xiàn)了明顯的沉淀線，制備的兔抗血清效價為1∶32，見圖4。

2.6 間接ELISA法檢測抗血清效價 經(jīng)五次免疫后，從兔心臟取血，以免疫前兔血清為陰性對照，ELISA測得兔抗血清的效價為1∶320 000以上，見圖5。

2.7 rClpC2蛋白的抗原性分析 以正常人血清的OD值+2S為正常界限值，ClpC2抗原在檢測肺結核病人中的檢出率為46%，檢測敏感性為46%，特異性為90%，見圖6。

2.8 間接ELISA檢測TB血清中ClpC2抗原 以正常人血清的OD值+2S為正常界限值，兔抗血清在檢測肺結核病人中的檢出率為40%，檢測敏感性為40%，特異性為90%，見圖7。

圖2 rClpC2的Western blot鑒定Fig.2 Western blot results of rClpC2

圖3 兔抗血清的Western blot鑒定Fig.3 Western blot results of rabbit antiserum

圖4 兔抗血清效價測定Fig.4 Determination of rabbit antiserum titer

圖5 兔抗血清效價的ELISA測定Fig.5 Detection of rabbit antiserum titer by ELISA

圖6 臨床血清ClpC2抗體的間接ELISA檢測結果Fig.6 Indirect ELISA test results of clinical serum ClpC2 antibody

圖7 臨床血清ClpC2抗原的間接ELISA檢測結果Fig.7 Indirect ELISA test results of clinical serum ClpC2 antigen

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，大部分原核生物擁有一種ATP依賴的酪氨酸蛋白酶復合物，而多數(shù)放線菌和古細菌體內含有的是蘇氨酸蛋白酶，有趣的是結核分枝桿菌擁有蘇氨酸蛋白酶和酪氨酸蛋白酶(Clp蛋白酶)這兩種蛋白酶，然而近年來對于結核分枝桿菌蛋白酶的研究主要集中于蘇氨酸蛋白酶方面［4］，而對于結核分枝桿菌Clp蛋白酶的研究相對較少。

原核生物的ATP依賴的蛋白酶Clp系統(tǒng)是由多個Clp蛋白組成的復合體，根據(jù)結構和功能的不同，大多數(shù)Clp蛋白可分為兩大類:ClpP蛋白家族和Hsp/Clp分子伴侶家族。Clp蛋白家族成員組成Clp蛋白酶的催化亞基(ClpP)，Hsp/Clp分子伴侶家族成員組成Clp蛋白酶的調節(jié)亞基(或稱為ATP酶亞基)，如 ClpA、ClpB、ClpC、ClpE 等。

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，Clp蛋白酶是病原菌致病力的基本元件。Clp蛋白通過調控毒力因子的表達影響細菌的毒力，在肺炎鏈球菌感染的小鼠模型中ClpP缺陷株的毒力低于野生型。ClpL不僅能調節(jié)幾種毒力因子的表達，還影響肺炎鏈球菌對宿主細胞的黏附和侵襲能力［5］;而在金黃色葡萄球菌中ClpC調節(jié)其主要毒力因子的轉錄［6］。Clp蛋白酶還參與菌體耐高溫、耐氧等應激反應，ClpB與單核細胞增多性李斯特菌和金黃色葡萄球菌能夠在高熱的情況下生長并且具有耐熱性有關［7］?？莶菅挎邨U菌ClpX的缺陷株對熱具有高度的敏感性［8］。在缺氧環(huán)境下，結核分枝桿菌Clp蛋白酶基因調節(jié)子ClgR(轉錄因子)的功能受到抑制，在細菌復制過程中控制其轉錄、翻譯和氧化磷酸化的基因也會受到抑制。若是恢復結核分枝桿菌的有氧條件，這些控制細菌轉錄的基因功能將會上調達到高潮。由此可以推斷ClgR作為轉錄調節(jié)子與結核分枝桿菌在缺氧條件下恢復轉錄功能有關［9］。

由此可以看出Clp蛋白酶可通過蛋白水解作用清除這些非正常和具有潛在毒性的蛋白或多肽，從而幫助病原菌適應宿主環(huán)境;這種蛋白酶系統(tǒng)還可通過蛋白水解作用控制細菌體內代謝過程中關鍵酶的穩(wěn)定性，保證菌體代謝的正常進行并在病原菌致病過程中發(fā)揮著重要功能。

然而，MTB較其他病原菌的ATP依賴的Clp蛋白酶系統(tǒng)更為復雜和獨特，它的Clp蛋白酶系統(tǒng)由雙拷貝的ClpP(包括ClpP1和ClpP2)和四個ATPase(ClpX、ClpC1、ClpC2、ClpB)組成，且 ClpP1 和 ClpP2與MTB的生長密切相關，敲除任何一個基因，都會導致MTB死亡，同時它們在菌體清除不正常蛋白的活動中發(fā)揮著重要作用［10］;研究發(fā)現(xiàn)，MTB 的ClpP1與ClpP2基因的共同缺陷菌株在巨噬細胞中的活力和毒力均會下降［11］;在MTB和許多的革蘭陽性菌中ClpC通常與ClpA直接同源，ClpC1的功能抑制，對培養(yǎng)和巨噬細胞中潛伏的MTB都具有致死性［12］?？股谻yclomarin A通過與酪氨酸蛋白酶調節(jié)亞基ClpC1結合，進而影響ClpC1P的蛋白水解作用，從而殺死結核分枝桿菌，所以ClpC1有可能成為結核分枝桿菌理想的藥靶候選蛋白［13］。目前，關于抗MTB ClpC2多克隆抗體的生物學特性及ClpC2蛋白酶在MTB生長能力、應激能力中的作用以及ClpC2P1或ClpC2P2的其他生物學功能等的相關研究，文獻所提供的信息較少。

另外，MTB抗原多而復雜，在宿主體內表達的數(shù)量、種類或時機有可能隨病人的個體免疫背景和病程而異，表現(xiàn)出不同的抗體譜，檢測時有的抗原不表達，未檢測出相應的抗體，有的抗體含量高，有的則低。Konstantin等［14］報道10種重組MTB蛋白抗原，分別檢測同一病人其反應有所不同。這就更增加了確認能適合大多數(shù)人群的診斷試劑所需抗原的困難性。因此多種抗原聯(lián)合檢測，在保證特異性的基礎上有助于提高靈敏度。

本研究通過純化蛋白得到純度較高的rClpC2，成功制備兔抗ClpC2多克隆抗體，制備的多克隆抗體可與 BCG中的 ClpC2發(fā)生抗原抗體反應，因ClpC2具有很高的保守性從而證實制備的多克隆抗體具有良好的特異性;首次采用純化的rClpC2和兔抗ClpC2多克隆抗體進行血清學檢測，發(fā)現(xiàn)在肺結核病人的血清學檢測中具有一定的敏感性和特異性，說明純化的rClpC2和兔抗ClpC2多克隆抗體可作為結核病血清學診斷的混合抗原或抗體之一。在今后的研究中，考慮多抗原或多抗體混合使用，嘗試不同抗原或抗體組合策略，以提高結核檢測的靈敏度和特異性。

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