蔡齊超 侯玉澤 鄧瑞廣 胡驍飛 王 耀 張小帆 王方雨
(河南科技大學食品與生物工程學院,洛陽 471003)
黃曲霉毒素M1(Aflatoxin M1,AFM1)是目前發(fā)現(xiàn)最穩(wěn)定的一種真菌毒素,具有二呋喃環(huán)結構,在365 nm的紫外線下可發(fā)出藍紫色的熒光[1,2]。AFM1的毒性很大,是氰化鉀的5倍,砒霜的40倍[3,4]。國際癌癥研究機構也一再提升AFM1的致癌等級,已從1993年的二類致癌物質提升為2002年的一類致癌物[2,5]。由于黃曲霉毒素M1大多見于嬰幼兒奶粉及其他乳制品中,而且目前缺乏行之有效的防治措施和去毒方法,因此世界各國均制定了嚴格的毒素殘留標準[6,7]。中國和俄羅斯要求在乳及乳制品中,黃曲霉毒素M1的最高限量為0.5 μg/kg;而日本和歐盟的要求更高,其最高限量為0.05 μg/kg[8]。目前檢測 AFM1 殘留的方法很多,主要包括薄層層析法(TLC)、高效液相色譜串聯(lián)質譜法(HPLC-MS)和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等[9-15]。由于TLC只能定性不能定量,而且所需時間長;HPLC操作復雜,儀器昂貴,并且對檢測樣品性質要求較高,所以它們都不適于現(xiàn)場大規(guī)模的檢測。而免疫學快速檢測方法因其特異性高、敏感性好、快速簡便、對樣品要求低等優(yōu)點,在小分子抗原檢測中具有非常廣闊的前景??贵w是免疫學檢測不可或缺的生物性原材料,人工抗原是抗體制備的前提,因此,成功合成AFM1人工抗原就顯得尤為重要,這為AFM1單克隆抗體制備及AFM1免疫學快速檢測試劑的研制奠定了堅實的基礎。
1.1 材料
1.1.1 溶液 溶液PBS(Phosphate buffered saline,0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液),洗液 PBST(PBS∶Tween20=2×103∶1),包被液 CBS(Carbonate buffered saline,0.05 mol/L NaHCO3/Na2CO3緩沖液),封閉液(PBST∶豬血清=20∶1),TMD 底物緩沖液,終止液(2 mol/L H2SO4)。
1.1.2 試劑 黃曲霉毒素 M1(Aflatoxin M1,AFM1),Sigma產品,純度≥98.0%;1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC),Thermo scientific公司產品;BSA和 OVA,弗氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant,F(xiàn)CA)和弗氏不完全佐劑(Freund’s incomplete adjuvant,F(xiàn)IA),Pierce 產品;羊抗兔酶標二抗(GaRIgG-HRP),華美生物工程有限公司;試驗用雙蒸水(ddw)由本實驗室制備;其他所用試劑均為市售AR(分析純)級。
1.1.3 儀器 U-3000紫外掃描儀(UV),日本島津公司;3K-18高速冷凍離心機,德國Sigma公司;Bio-Rad-550型酶標儀,美國Bio-Rad公司;HI9321酸度計,美國 HANNA公司;AE260電子天平,德國METTLER公司;ZF-7三用紫外分析儀,鞏義予華儀器有限責任公司;XMTD-8222電熱恒溫水浴鍋,上海一恒科技有限公司;JM-250電泳儀,大連捷邁科貿有限公司;超純水儀,Millipore產品。
1.1.4 試驗動物 購自鄭州大學醫(yī)學院實驗動物中心的6周齡雌性BALB/c小鼠,均為SPF級,由河南省動物免疫學重點實驗室飼養(yǎng)。
1.2 方法
1.2.1 人工抗原的合成
1.2.1.1 AFM1肟(AFM1O)的制備 將2 mg的AFM1和4 mg的氨氧基乙酸半鹽酸鹽(CMO)溶于2 ml吡啶甲醇水的混合液中(吡啶∶甲醇∶雙蒸水=1∶4∶1),控溫(120℃)回流,薄層色譜法監(jiān)測反應進程。待反應完全,用旋轉蒸發(fā)儀將溶劑旋干,加入2 ml ddw溶解,用2 mol/L的H2SO4調節(jié)pH=4,再用5 ml乙酸乙酯萃取2~3次,合并有機相,并用 ddw洗滌2次,再次旋干液體,得到的黃色油狀物質即是AFM1O。
1.2.1.2 完全抗原的制備 AFM1-BSA的制備:用0.4 ml N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解 AFM1O,取0.2 ml再加入0.3 ml ddw配成N,N-二甲基甲酰胺和水(DMF∶H2O=2∶3)的混合溶液,加入 1 mg EDC,室溫避光活化4 h后,再補加1 mg EDC,此為A液。稱3.35 mg BSA,用0.13 mol/L的 NaHCO3溶液(2.76 ml)制成10%BSA活化溶液,此為B液。將B液逐滴加入到A液中,避光攪拌24 h。在4℃下用PBS攪拌透析3 d,每天換液4次,離心去沉淀獲得純化的AFM1-BSA[16,17]。AFM1O-OVA 的 制備:方法同上,用 OVA(2.13 mg)取代 BSA,得到AFM1O-OVA,反應方程如圖1。
1.2.2 薄層層析法鑒定 將肟化物用少量二甲基甲酰胺(DMF)溶解,以10 ml氯仿和甲醇的混合液(氯仿∶甲醇=9∶1)為展開劑,用鉛筆在硅膠板上畫兩道線,用毛細管在一條線上點樣,插入盛有展開劑的容器中,點樣線在下但高于液面。在展開劑層析到另一條線時,取出硅膠板,在暗室中,用365 nm的紫外分析儀照射,觀察并記錄亮斑反應方程如圖2。
1.2.3 紫外掃描鑒定 用PBS配制AFM1、BSA和OVA標準溶液,調節(jié)合成抗原的濃度與標準溶液相一致,用紫外掃描儀測定,在波長220~440 nm范圍內得到最大吸收峰及特征值。
1.2.4 SDS-PAGE凝膠電泳鑒定 按照文獻[18]介紹的方法配制所需電泳溶液。基于所分離蛋白比較單一,且分子量相當大,選擇電泳條件:濃縮膠濃度為5%,分離膠濃度為12%,濃縮膠電壓90 V,分離膠電壓100 V,上樣量為20 μl,考馬斯亮藍染色4 h后,置脫色液中脫色,為加快進程,可更換2~3次脫色液。
1.2.5 免疫學方法(ELISA)鑒定
1.2.5.1 動物免疫 取高壓PBS溶解AFM1-BSA至50 μg/ml,與等量弗氏完全佐劑(首免用完全佐劑,之后用不完全佐劑)混合,用乳化器充分乳化后,免疫小鼠。小鼠背部皮下6點注射,免疫劑量為0.2 ml/只,共免4次,免疫間隔為21 d。三免后10 d 斷尾采血 10 μl至 990 μl PBS 中,4 000 r/min 離心取上清,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.5.2 包被板的制備 首先,AFM1-OVA包被,包被濃度和包被量分別為 5 μg/ml和 50 μl/孔,37℃溫育2 h,PBST洗板5次;然后,用5%豬血清封閉220 μl/孔,37℃溫育1 h,PBST 洗5 次,晾干后4℃保存。
1.2.5.3 多抗血清(pAb)效價測定 采用間接ELISA方法測定多抗血清效價。第一步,用5%豬血清鋪底50 μl/孔,在第一行加小鼠血清 50 μl/孔,倍比稀釋到倒數(shù)第二行,設陰性對照(NC,即用未免疫AFM1-BSA的小鼠血清)和空白對照(BC),37℃溫育15 min,洗5次;第二步,加GaMIgG-HRP,用5%豬血清1∶1 000 倍稀釋,50 μl/孔,37 ℃溫育 30 min,洗 6次;第三步,加TMB顯色50 μl/孔,室溫反應10 min;第四步,加 2 mol/L H2SO4終止反應 50 μl/孔,讀OD450;第五步,結果判斷:以待測孔 OD450值≥NC OD450值的2.1 倍(P/N≥2.1),判為陽性[19]。
1.2.5.4 多抗血清(pAb)抑制價測定 采用阻斷ELISA鑒定pAb抑制價。方法與1.2.5.3基本相同,只是第一步略有不同,改為用5%豬血清鋪底50 μl/孔,加 OD450為 1.0左右的小鼠血清50 μl和不同濃度的 AFM1標準品作抑制劑,設NC和 BC,37℃溫育15 min,PBST洗5次。最后計算抑制率(B/B0,B0為 AFM1濃度為0時的OD450,B為不同濃度 AFM1的 OD450)。以 B/B0為縱坐標,以AFM1濃度的對數(shù)值為橫坐標,繪制抑制曲線,根據(jù)曲線趨勢推導回歸方程,計算小鼠多抗血清對AFM1的50%抑制濃度(IC50),以 IC50衡量其敏感度[20]。
2.1 TLC鑒定肟化物 由圖3可知,遷移距離較遠的是 AFM1標準品,遷移距離較近的為肟化物AFM1O。AFM1與CMO的反應完全時間很難確定,但是TLC能夠確定肟化反應的進程,所以采用TLC可以確定AFM1與CMO反應完全的時間。在查閱的文獻中,回流反應的時間有很多,有回流2 h、2.5 h、3.5 h、4 h和5 h。本實驗用TLC確定反應進程,自回流2 h后開始檢測。圖3A是還未開始反應時的TLC檢測,點樣AFM1標品和混合液。圖3B是在肟化反應2 h時TLC檢測,點樣AFM1標品和混合液。圖3C是肟化反應2.5 h時TLC檢測,點樣AFM1標品和混合液。
2.2 UV鑒定人工抗原 用U-3000紫外掃描儀對AFM1、BSA、AFM1-BSA 在 220~440 nm 波長范圍進行掃描。由圖4可看到BSA在280nm處有吸收峰,AFM1在262 nm處有吸收峰,而偶聯(lián)物AFM1-BSA在274 nm處出現(xiàn)最大吸收峰,與BSA和AFM1的最大吸收峰均不重合,證明偶聯(lián)成功。
圖1 AFM1O的制備Fig.1 Preparation of AFM1O
圖2 AFM1人工抗原和檢測抗原的制備Fig.2 Preparation of AFM1 artificial antigen and coated antigen
2.3 SDS-PAGE鑒定人工抗原 由圖5可知,AFM1-BSA的泳動速度小于BSA,而且有較明顯的擴散現(xiàn)象,說明BSA的分子量小于AFM1-BSA,證明AFM1與BSA偶聯(lián)成功。
2.4 ELISA鑒定人工抗原
2.4.1 ELISA測定pAb效價 由表1可知,免疫的3只小鼠血清抗體效價均達到了1×10-4,其中1號小鼠最高,達到1∶1.28×104,說明用 AFM1-BSA 免疫小鼠能夠獲得較好的免疫效果。
2.4.2 阻斷ELISA測定pAb敏感性 選取抑制最好的3號小鼠做標準抑制曲線。由圖6可知,3號小鼠的標準抑制曲線的線性回歸方程為y=-0.246 5x+1.130 1,相關系數(shù) R2=0.970 4,IC50=359.9 ng/ml,表明3號小鼠的血清對AFM1具有較高的敏感性。說明免疫抗原和檢測抗原均偶聯(lián)成功。
表1 3只小鼠pAb間接ELISA效價測定結果Tab.1 Titers of polyclonal antibodies of three BALB/c mice detected by indirect ELISA
圖3 AFM1和AFM1O的薄層色譜圖Fig.3 TLC of AFM1 and AFM1-BSA
圖4 BSA、AFM1和AFM1-BSA的紫外掃描光譜Fig.4 UV scanning spectrum of BSA,AFM1 and AFM1-BSA
圖5 AFM1-BSA偶聯(lián)物的SDS-PAGE鑒定Fig.5 Identification of AFM1-BSA conjugation by SDSPAGE
圖6 阻斷ELISA檢測3號小鼠AFM1 IC50Fig.6 IC50inhibitive curve of mice 3 AFM1 polyclonal antiserum by competitive ELISA
3.1 AFM1抗原偶聯(lián)方法 AFM1是小分子物質,屬于半抗原,即只有反應原性,無免疫原性,因此只有將其與具有免疫性的大分子載體蛋白偶聯(lián)后,才能形成完全抗原。由于AFM1分子構象中并沒含有羧基等易與載體蛋白相結合的基團,故本實驗采用肟化法在AFM1分子構象上添加一個羧基,以便接下來用碳化二亞胺法(EDC)分別制備出免疫抗原和檢測抗原。
3.2 TLC確定肟化完全 本文采用TLC法來確定肟化反應的進程。AFM1和CMO回流反應,反應完全時間很難確定。本實驗將AFM1和CMO在雙頭燒瓶進行回流,這可方便取液檢測。TLC確定反應進程,自回流2 h后開始檢測,每隔0.5 h TLC檢測,在2.5 h時已經完全反應。用TLC確定了反應物完全肟化,不僅縮短了試驗時間,提高了效率,而且還減少了加熱時間過長引起的許多副反應的發(fā)生。
3.3 AFM1偶聯(lián)物的鑒定 鑒定免疫抗原和檢測抗原的方法一般有紫外掃描光譜法、SDS-PAGE電泳法和 ELISA法。通過紫外掃描,可知偶聯(lián)物AFM1-BSA和AFM1-OVA的最大特征吸收峰與BSA、OVA的最大吸收峰及AFM1的最大吸收峰均不重合,證明AFM1-BSA和AFM1-OVA合成成功。因為AFM1-BSA和AFM1-OVA與BSA和OVA的分子質量不同,采用SDS-PAGE凝膠電泳跑蛋白膠,它們的泳動速率也會不同,AFM1-BSA和BSA、AFM1-OVA和OVA能明顯錯開,所以證明AFM1-BSA和AFM1-OVA合成成功。ELISA法是將制備的免疫原免疫小鼠,均獲得良好效價,做敏感性實驗時,3號小鼠的IC50達到了359.9 ng/ml,這也證明小分子AFM1偶聯(lián)載體蛋白成功。
本實驗合成并鑒定了AFM1的人工抗原,獲得敏感性好、特異性強的多克隆抗體,為進一步篩選AFM1單克隆抗體和研制AFM1快速檢測試劑盒或試紙條打下了良好的基礎。
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