李鳳武，胡 燕*，段金虹，許海燕，楊先達*

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 1.病理與病理生理系；2.生物醫(yī)學(xué)工程系, 北京 100005)

研究論文

核酸適配體修飾的鐵納米粒對HER2陽性乳腺癌的靶向熱療效應(yīng)

李鳳武1，胡 燕1*，段金虹1，許海燕2，楊先達1*

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 1.病理與病理生理系；2.生物醫(yī)學(xué)工程系, 北京 100005)

目的研發(fā)能提高HER2陽性乳腺癌熱療效應(yīng)的核酸適配體-鐵納米粒子復(fù)合體(AptNPs)，探索腫瘤靶向治療的全新途徑。方法利用生物素和鏈霉親和素的結(jié)合反應(yīng)構(gòu)建AptNPs，用動態(tài)光散射粒徑儀表征其尺寸分布，用流式細胞儀和相差顯微鏡檢測AptNPs的靶向結(jié)合能力，MTS法測其對磁場下抗腫瘤熱療效果的影響。結(jié)果通過生物素-親和素反應(yīng)構(gòu)建了AptNPs，其平均直徑為333.7 nm，對HER2陽性細胞有較強的結(jié)合，對HER2陰性細胞沒有結(jié)合。此外，AptNPs可顯著提升對HER2陽性細胞的熱療殺傷率(Plt;0.05)，但對 HER2陰性細胞的熱療后殺傷率影響較小。結(jié)論AptNPs能靶向性地提升針對HER2陽性腫瘤細胞的熱療效率，在研發(fā)新型腫瘤靶向熱療方面具有潛在應(yīng)用價值。

核酸適配體；熱療；HER2陽性；乳腺癌

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤[1]，其中20%～30%高表達HER2蛋白[2]。HER2陽性乳腺癌預(yù)后差且侵襲性高[3]。目前針對HER2陽性乳腺癌的靶向治療藥物是西妥昔單抗[4]，但大多數(shù)患者會產(chǎn)生耐藥性[5]，因此急需靶向HER2的新型療法。鐵納米?？梢栽诮蛔兇艌鑫諢崃浚瑢δ[瘤細胞產(chǎn)生熱殺傷效應(yīng)[6]。但該熱療效應(yīng)不具備HER2靶向性。HER2適配體是經(jīng)篩選得到的單鏈寡核苷酸，能以較高的特異性和較強的親和力(KDlt;20 nmol/L)識別HER2結(jié)構(gòu)[4]，是一類新型的HER2靶向分子[7-8]。本研究通過生物素與鏈霉親和素間的高效相互作用(KD為10-6nmol/L)，將HER2適配體和鐵納米粒連接，構(gòu)建了能夠靶向HER2的適配體-鐵納米粒復(fù)合物(AptNPs)， 并在體外初步評估了其對HER2陽性腫瘤細胞的靶向熱療效果。

1 材料與方法

1.1 材料

SK-BR-3和MDA-MB-231細胞系(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細胞中心)，鐵磁納米粒(Promaga公司)，親和素修飾引物、FITC修飾引物和FAM修飾引物(Invitrogen公司)，Taq酶和dNTP(Genstar公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)： SK-BR-3培養(yǎng)于含20%胎牛血清的改良型1640；MDA-MB-231培養(yǎng)于含10% 胎牛血清的DMEM(高糖型)。兩種細胞系培養(yǎng)在37 ℃、5% 的CO2培養(yǎng)箱中。所有細胞實驗均使用對數(shù)增值期的細胞。

1.2.2 AptNPs的構(gòu)建：PCR獲得P1-biotin修飾的雙鏈HER2 核酸適配體(95 ℃，40 s; 55 ℃，30 s；72 ℃，40 s；25個循環(huán))?；旌?0 pmol PCR產(chǎn)物和10 μL鏈霉親和素修飾的鐵納米粒，室溫下振蕩15 min。PBS洗滌3次，加40 mmol的NaOH振蕩5 min，棄上清，10 μL PBS重懸。

1.2.3 流式檢測：PCR獲得P1-FITC修飾的雙鏈HER2核酸適配體。混合20 pmol PCR產(chǎn)物和20 μL鏈霉親和素修飾的鐵納米粒，室溫下振蕩15 min。PBS洗滌3次，加100 mmol的NaOH室溫振蕩5 min，取上清，加入等體積的100 mmol鹽酸，混勻。分別加入SK-BR-3和MDA-MB-231細胞中，37 ℃搖床孵育30 min，PBS洗滌4次，重懸，流式檢測。

混合25 pmol的FAM標記的HER2 雜交探針與10 μL AptNPs，室溫下振蕩30 min，PBS洗滌3次，200 μL PBS重懸，流式檢測。

1.2.4 相差顯微鏡成像：SK-BR-3培養(yǎng)于6孔板，加入50 μL AptNPs，37℃搖床孵育1 h，PBS洗滌3次，室溫下加入4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌2次，室溫下普魯士藍染液孵育20 min，PBS洗滌2次，重懸，在相差顯微鏡下觀察。

1.2.5 表征檢測： 吸取10 μL AptNPs，用雙蒸水稀釋到1 mL，在動態(tài)光散射粒儀下檢測AptNPs的尺度分布。

1.2.6 MTS檢測： SK-BR-3和MD-MBA-231接種于96孔板，分別加入10 μL AptNPs、游離核酸適配體、游離鐵納米粒，37 ℃搖床孵育1 h，PBS洗滌3次，無血清培養(yǎng)基重懸，在交變電磁場中孵育數(shù)小時，以標準MTS法檢測細胞存活率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HER2核酸適配體的結(jié)合性質(zhì)

在HER2陽性的SK-BR-3細胞中，HER2核酸適配體(HER2-Apt)熒光強度較隨機DNA(Random)明顯增強，曲線右移(黑色)，HER2核酸適配體能夠結(jié)合HER2陽性腫瘤細胞(圖1A)；在HER2陰性的MDA-MB-231細胞中，HER2核酸適配體與隨機DNA的熒光強度基本相同，沒有明顯位移，HER2核酸適配體基本不能結(jié)合HER2陰性的腫瘤細胞(圖1B)。

圖1 HER2 核酸適配體的結(jié)合性質(zhì)的流式分析Fig 1 The bindings of the HER2 aptamer to the HER2- positive SK-BR-3 and the HER2-negative MDA-MB-231 breast cancer cells

2.2 AptNPs的構(gòu)建

相比于control, HER2探針處理后熒光強度明顯增強，曲線右移(黑色)，HER2適配體連接到了AptNps上(圖2A)；而游離鐵納米粒熒光強度沒有變化，未見曲線位移(黑色)，HER2適配體沒有連接到游離鐵納米上(圖2B)。

A.binding of the FAM-labeled probes to beads coated with HER2 aptamer; B.binding of the FAM-labeled probes toblank beads圖2 流式細胞儀檢測AptNP HER2適配體Fig 2 Binding of the FAM-labeled probes to beads coated with Hev2 aptamer or blank beads

2.3 AptNPs的尺度表征

AptNPs的平均直徑為333.7 nm，空鐵納米粒的平均直徑為303.1 nm，兩者尺度相似(圖3)。

圖3 動態(tài)光散射粒徑儀對納米粒子尺度的評估Fig 3 Size distributions of blank NPs (above) and the AptNPs (below) detected by DSL

2.4 AptNPs對HER2陽性細胞的特異性結(jié)合

AptNPs在HER2陽性細胞中有較強的普魯士藍染色，對HER2陽性細胞有較強的結(jié)合(圖4A)，對HER2陰性細胞染色較淺、結(jié)合較弱(圖4C)；而空白NPs對HER2陽性及陰性細胞都染色較淺、結(jié)合較弱(圖4B, D)。

A.bindings of AptNPs to HER2-positive SK-BR-3; B.bindings of blank NPs to HER2-positive SK-BR-3; C.bindings of AptNPs to HER2-negative MDA-MB-231; D.bindings of blank NPs to HER2-negative MDA-MB-231; the particles were incubated with the cells, washed, and stained with Prussian blue to outline the iron-containing NPs圖4 AptNPs對HER2陽性細胞的結(jié)合特異性分析Fig 4 Binding of AptNPs to Her-positive SK-BR-3 tumor cells

2.5 AptNPs對熱療效果的增強作用

AptNPs能顯著提升對HER2陽性腫瘤的熱殺傷效率(Plt;0.05)，而NPs和HER2 Apt沒有明顯作用(圖5A)；相反，在HER2陰性細胞中，AptNPs、NPs、HER2 Apt皆沒有顯著的熱療提升作用(圖5B)，提示AptNPs可靶向性地提升針對HER2陽性腫瘤的熱療效應(yīng)。

3 討論

本實驗的目的是利用核酸適配體介導(dǎo)的鐵納米粒提高對HER2陽性乳腺癌的熱療效率。由于HER2陽性乳腺癌預(yù)后較差，且目前西妥昔單抗的應(yīng)用受到耐藥性的限制，因此迫切需要研究新型的靶向HER2的療法。

A.AptNps enhanced the thermal therapies efficacy against the HER2-postive SK-BR-3 cells; B.AptNps had little effect on the thermal therapies efficacy against the HER2-negative MDA-MB-231 cells; *Plt;0.05 compared with NPs圖5 AptNPs對乳腺癌細胞熱療效應(yīng)的影響Fig 5 AptNPs enhanced the thermal the rapies efficacy against Her2-positive SK-BR-3 cells but not the Her2-negative MD-MB-231 cells

本實驗構(gòu)建了一個核酸適配體-鐵磁納米粒復(fù)合體，與單純鐵磁納米粒大小幾乎無差異，可見核酸適配體的修飾并沒有改變鐵磁納米粒的大小。對SK-BR-3細胞有較強的結(jié)合而對MDA-MB-231細胞基本沒有結(jié)合。此外，AptNPs能夠結(jié)合HER2陽性乳腺癌細胞，而對HER2陰性細胞結(jié)合較弱，提示AptNPs能靶向結(jié)合HER2陽性腫瘤細胞，具有提升靶向熱療效應(yīng)的潛能。尤為重要的是，AptNPs還特異性地提升針對HER2陽性細胞的熱療效果，而對HER2陰性細胞沒有影響。

本實驗首次嘗試將HER2核酸適配體與鐵納米粒結(jié)合，并應(yīng)用于HER2陽性乳腺癌的靶向熱療當(dāng)中。傳統(tǒng)熱療中的熱敏劑不具靶向作用，分散在機體各處，稀釋了有效濃度，有可能降低熱療效果，甚至產(chǎn)生其他系統(tǒng)的病變。而AptNPs有可能選擇性地結(jié)合腫瘤細胞，從而改善現(xiàn)有熱療的效果。未來研究應(yīng)致力于評估靶向熱敏劑的體內(nèi)效應(yīng)，并深入研究核酸適配體的降解、鐵磁納米粒的代謝等一系列問題。

綜上所述，AptNPs能選擇性地提升針對 HER2陽性乳腺癌細胞的熱療效應(yīng)。該結(jié)果提示，核酸適配體所介導(dǎo)的鐵熱敏劑，在針對HER2乳腺癌的靶向熱療中具有潛在的應(yīng)用價值，并且為其他腫瘤的熱療提供了新的思路和方法。

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Enhancement of thermal damage to HER2-positivebreast cancer cells by aptamer-guided magnetic nanoparticles

LI Feng-wu1, HU Yan1*, DUAN Jin-hong1, XU Hai-yan2, YANG Xian-da1*

(1.Dept. of Physiology and Pathophysiology; 2.Dept. of Biomedical Engineering, Institute of Basic Medical Science,CAMS amp; PUMC, Beijing 100005, China)

ObjectiveTo develop aptamer-modified nanoparticles (AptNPs) for targeted enhancement of thermal damage to HER2-positive breast cancer cells.MethodsHER2 aptamer was connected to NPs via biotin-streptavidin reaction. AptNPs were characterized by Dynamic Light Scattering (DLS). The binding feature of the aptamer was evaluated by flow cytometry, and the affinity of AptNPs to target cells by phase-contrast microscopy. Thermal damage under alternative magnetic field was measured by MTS assay.ResultsThe average size of AptNPs was 333.7 nm. AptNPs exhibited strong binding to the HER2-positive but not the HER2-negative cells. Importantly, AptNPs enhanced the thermal damage to the HER2-positive tumor cells, but not that to the HER2-negative cells.ConclusionsAptamer-guided iron particles may have potential utility in development of novel HER2-targeted thermal therapies.

aptamers; thermal therapy; HER2-targeted; breast cancer

2013-12-31

2014-03-12

科技部重大科學(xué)計劃 (2011CB933504, 2011CB911004，2011CB911003)

*通信作者(correspondingauthor)：hyjy2008@hotmail.com；ayangmd@gmail.com

1001-6325(2014)05-0644-04

R 730.54

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