曾憲玉 姜敏 付辰 董碧麟 吳卓漩 王瑋蓁

武漢市丙酸桿菌對(duì)紅霉素耐藥與23S rRNA點(diǎn)突變和攜帶erm基因相關(guān)

曾憲玉 姜敏 付辰 董碧麟 吳卓漩 王瑋蓁

目的探討武漢市耐紅霉素丙酸桿菌23S rRNA有無(wú)點(diǎn)突變以及攜帶ermX基因的Tn5432轉(zhuǎn)座子是否轉(zhuǎn)入了丙酸桿菌。方法從痤瘡患者皮損中分離丙酸桿菌,E-test法檢測(cè)分離株對(duì)紅霉素和克林霉素的MIC值。PCR擴(kuò)增耐藥株23S rRNA、ermX、ermX(cj)、IS1249a、IS1249b并測(cè)序,并在基因庫(kù)中比較。結(jié)果19株痤瘡丙酸桿菌(P.acnes)和10株卵白丙酸桿菌(P.avidum)對(duì)紅霉素均表現(xiàn)為高度耐藥(MIC均＞256 μg/ml)。19株P(guān).acnes中,16株對(duì)克林霉素高度耐藥(MIC＞256 μg/ml),3株敏感;10株P(guān).avidum對(duì)克林霉素高度耐藥(MIC＞256 μg/ml)。19株P(guān).acnes耐藥株中,7株在相當(dāng)于E.coli23S rRNA 2058位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)由A→G點(diǎn)突變,均對(duì)紅霉素和克林霉素高度耐藥;4株在相當(dāng)于E.coli23S rRNA 2059位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)由A→G點(diǎn)突變,其中1株對(duì)克林霉素耐藥,3株敏感;另外8株P(guān).acnes擴(kuò)增ermX陽(yáng)性,其序列與基因庫(kù)中P.acnesermX基因100%同源。10株P(guān).avidum中,2株ermX擴(kuò)增陽(yáng)性,其序列與P.acnesermX基因100%同源;另外8株擴(kuò)增ermX(cj)得到預(yù)期片段PCR產(chǎn)物,與基因庫(kù)中Corynebacterium jeikeiumermX(cj)序列99%同源,而與P.acnesermX基因僅有94%的同源性。10株擴(kuò)增ermX基因陽(yáng)性的菌株擴(kuò)增IS1249a和IS1249b均陽(yáng)性,而其余菌株均陰性。結(jié)論武漢市耐紅霉素丙酸桿菌分別由相當(dāng)于E.coli23S rRNA 2058、2059由A→G點(diǎn)突變、攜帶ermX的Tn5432傳入以及ermX(cj)傳入丙酸桿菌引起。

丙酸桿菌屬;紅霉素;克林霉素;23S rRNA;基因,erm

作者單位:430022武漢市第一醫(yī)院皮膚科(曾憲玉、姜敏、付辰、董碧麟、吳卓璇、王瑋蓁);湖南中醫(yī)藥大學(xué)(曾憲玉)

痤瘡丙酸桿菌(P.acnes)是引起痤瘡炎癥反應(yīng)的重要致病菌,隨著紅霉素和克林霉素制劑外用治療痤瘡,丙酸桿菌對(duì)紅霉素和克林霉素耐藥報(bào)道在歐洲、美洲、大洋洲和亞洲等地區(qū)相繼出現(xiàn)[1-2]。國(guó)外研究表明:丙酸桿菌23S rRNA的點(diǎn)突變和攜帶紅霉素耐藥基因是其耐紅霉素的機(jī)制,并根據(jù)基因點(diǎn)突變的不同位點(diǎn)將其分為4個(gè)不同的耐藥表型[3]。我們?cè)谇捌赱4]實(shí)驗(yàn)中已從痤瘡患者皮損中分離到耐紅霉素丙酸桿菌,本研究擬了解耐藥株23S rRNA有無(wú)點(diǎn)突變以及攜帶ermX基因的Tn5432轉(zhuǎn)座子是否轉(zhuǎn)入了丙酸桿菌。

資料與方法

一、資料

1.菌株:29株丙酸桿菌分離株均從2009—2010年武漢市第一醫(yī)院皮膚科門診痤瘡患者皮損中分離,經(jīng)革蘭染色、23S rRNA測(cè)序鑒定為丙酸桿菌。29例中,15例在取材前服用過(guò)多西環(huán)素、米諾環(huán)素或羅紅霉素至少2周以上;4例外用過(guò)克林霉素制劑;4例同時(shí)外用克林霉素和口服上述抗生素;6例無(wú)明確的抗生素治療史。經(jīng)鑒定的丙酸桿菌分離株[4]用LB溶液保存于-80℃冰箱。進(jìn)行E-test藥敏試驗(yàn)前至少轉(zhuǎn)種厭氧培養(yǎng)兩次。P.acnesATCC11827購(gòu)自美國(guó)ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌庫(kù)。

2.主要試劑和儀器:強(qiáng)化布氏瓊脂、布氏肉湯、紅霉素和克林霉素E-test條、厭氧產(chǎn)氣袋、厭氧試劑條、比濁儀均購(gòu)于法國(guó)梅里埃公司,TaqDNA聚合酶和dNTP由上海invitrogen公司提供。PCR擴(kuò)增儀購(gòu)于德國(guó)Eppendorf公司。

二、方法

1.E-test藥敏方法:參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)第7版關(guān)于厭氧菌藥敏試驗(yàn)指南和文獻(xiàn)[2],采用E-test方法檢測(cè)分離丙酸桿菌菌株紅霉素和克林霉素藥敏試驗(yàn)。主要步驟如下:按要求配置5%羊血強(qiáng)化布氏瓊脂(每1 000 ml含43 g強(qiáng)化布氏瓊脂、維生素K1溶液1 ml、氯化血紅蛋白溶液1 ml),制備5%強(qiáng)化布氏瓊脂血平板。-4℃保存?zhèn)溆?。?～3個(gè)轉(zhuǎn)種2次以上的單菌落,用布氏肉湯調(diào)整至0.5麥?zhǔn)媳葷?分3個(gè)方向均勻涂布于5%強(qiáng)化布氏瓊脂血平板,室溫放置15min,放置E-test條。厭氧培養(yǎng)48 h,觀察結(jié)果。P.acnesATCC11827作為陰性對(duì)照。

2.DNA提取:按文獻(xiàn)進(jìn)行操作[5],獲得單菌落的分離菌株后,取單個(gè)菌落加入200 μl DB溶液,100℃10min,-20℃2 h以上,11 700×g離心3min,取上清,加200 μl 1/2 TE溶液,獲得DNA模板。-20℃保存。

3.引物、PCR和測(cè)序:擴(kuò)增丙酸桿菌23S rRNA、ermX、ermX(cj)、IS1249a、IS1249b 引 物 和PCR反應(yīng)條件見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增條件:每個(gè)25 μl PCR反應(yīng)體系組成如下:5 μl DNA模板、正向引物和反向引物(100 pmol/μl)分別 0.25 μl,1.25 dNTP(各 2.5 mmol/L),2.5 μl 10 × 緩沖液、0.1 μl DNA Taq 聚合酶(5 U/μl),加水至 25 μl。 IS1249b 擴(kuò)增體系中, 除dNTP為2.0 μl及0.2 μl DNA Taq聚合酶外,余體系同上。以H2O作為陰性對(duì)照。取6 μl PCR產(chǎn)物在1.2%凝膠上電泳判讀結(jié)果。所有擴(kuò)增產(chǎn)物均用上游引物單向測(cè)序。引物合成和測(cè)序均由武漢華大基因公司完成。

表1 引物序列和PCR擴(kuò)增條件

結(jié) 果

一、分離株鑒定結(jié)果

29株菌23S rRAN引物擴(kuò)增均得到預(yù)計(jì)片段大小的PCR產(chǎn)物(430 bp),序列在基因庫(kù)中Blast結(jié)果顯示:19株分離株的23S rRNA擴(kuò)增序列與P.acnes23S rRNA序列(NR_076216.1)顯示有98%～100%的一致性;結(jié)合革蘭染色,鑒定為P.acnes。另外10株分離株的23S rRNA擴(kuò)增序列與卵白丙酸桿菌(P.avidum)23S rRNA序列(基因庫(kù)No:NR_103003.1)顯示有99%～100%的同源性;結(jié)合革蘭染色,鑒定為P.avidum。

二、藥敏結(jié)果

19株P(guān).acnes和10株P(guān).avidum均對(duì)紅霉素表現(xiàn)為高度耐藥,MIC均 ＞256 μg/ml。19株P(guān).acnes中,16株對(duì)克林霉素高度耐藥(MIC＞256 μg/ml),3株敏感;10株P(guān).avidum對(duì)克林霉素高度耐藥(MIC＞ 256 μg/ml)。

三、23S rRNA和erm基因測(cè)序結(jié)果

19株P(guān).acnes中,7株在相當(dāng)于E.coli23S rRNA2058點(diǎn)發(fā)現(xiàn)由A→G點(diǎn)突變(圖1),均對(duì)紅霉素和克林霉素高度耐藥(MIC＞256 μg/ml);4株在相當(dāng)于E.coli23S rRNA 2059位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)由A→G突變(圖1),其中1株分離株對(duì)克林霉素高度耐藥(MIC ＞ 256 μg/ml),3 株敏感(MIC 1.5 ～ 2 μg/ml);另外8株23S rRNA未檢測(cè)到點(diǎn)突變的分離株ermX擴(kuò)增得到預(yù)期片段PCR產(chǎn)物(395 bp,圖2),其序列均與基因庫(kù)中P.acnesermX基因100%同源(基因庫(kù) No:AF411029.1)。10株P(guān).avidum耐藥株中,在相當(dāng)于E.coli23S rRNA 2058、2059位點(diǎn)均未發(fā)現(xiàn)點(diǎn)突變;2株ermX擴(kuò)增得到預(yù)期片段PCR產(chǎn)物(圖2),其序列與基因庫(kù)中P.acnesermX基因100%同源(基因庫(kù) No:AF411029.1);另外8株擴(kuò)增ermX(cj)得到預(yù)期片段PCR產(chǎn)物(圖2,394 bp),與基因庫(kù)中Corynebacterium jeikeiumermX(cj)序99%同源(基因庫(kù)No:AF338706.1),相差一個(gè)堿基,而與P.acnesermX基因僅有94%的同源性。所有耐藥株在相當(dāng)于E.coli23S rRNA 2057位點(diǎn)均未檢測(cè)到堿基突變。見(jiàn)表2。

圖1 擴(kuò)增P.acnes分離株23S rRNA在相當(dāng)于E.coli23S rRNA 2058及2059位點(diǎn)的由A→G突變

圖2 丙酸桿菌ermX PCR和ermX(cj)PCR擴(kuò)增結(jié)果 1:陰性;2～5:ermX(cj);6:陰性;7～10:ermX;M:標(biāo)準(zhǔn)參照物

表2 紅霉素耐藥丙酸桿菌的耐藥結(jié)果

四、IS1249a和IS1249b擴(kuò)增結(jié)果

10株攜帶P.acnesermX的菌株均擴(kuò)增出IS1249a及IS1249b的預(yù)期片段產(chǎn)物(分別為454 bp和1 105 bp,圖3),序列Blast顯示與基因庫(kù)中Tn5432轉(zhuǎn)座子中IS1249a和IS1249b分別具有100%的同源性(基因庫(kù)No:AF411029.1)。23S rRNA 2058和2059點(diǎn)突變菌株和攜帶99%Corynebacterium jeikeiumermX(cj)基因的菌株IS1249a及IS1249b PCR擴(kuò)增均為陰性。

討 論

耐紅霉丙酸桿菌菌株最初報(bào)道見(jiàn)于美國(guó),后在歐洲和亞洲等地區(qū)相繼出現(xiàn)[1-2]。Ross根據(jù)其對(duì)大環(huán)類酯類-林可霉素類-鏈陽(yáng)性霉素B類抗生素(MLS)MIC的差別,分為4個(gè)耐藥表型:Ⅰ型為對(duì)所有MLS類抗生素固有耐藥;Ⅱ型為所有大環(huán)類酯抗生素固有低度耐藥和誘導(dǎo)性高度耐藥;Ⅲ型僅對(duì)紅霉素耐藥,對(duì)16環(huán)大環(huán)類酯抗生素敏感;Ⅳ型對(duì)所有的14環(huán)、15環(huán)和16環(huán)大環(huán)類酯類高度耐藥,對(duì)克林霉素敏感[1]。隨后研究證明Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型耐藥分別由相當(dāng)于E.coli23S rRNA的2058(A→G)、2057(G→A)、2059(A→G)的基因點(diǎn)突引起[3],而Ⅱ型由攜帶了位于轉(zhuǎn)座子中的紅霉素耐藥基因ermX引起[6]。本研究中,共7株在相當(dāng)于E.coli23S rRNA 2058位點(diǎn)出現(xiàn)由A→G的突變,均表現(xiàn)為對(duì)紅霉素和克林霉素高度耐藥,與文獻(xiàn)報(bào)道耐藥表型一致;4株在相當(dāng)于E.coli23S rRNA 2059位點(diǎn)出現(xiàn)由A→G的突變,均對(duì)紅霉素高度耐藥,但3株對(duì)克林霉素敏感、另外1株耐藥,其藥敏表型與文獻(xiàn)結(jié)果有差異,原因不明。10株攜帶ermX的P.acnes和P.avidum均對(duì)紅霉素和克林霉素高度耐藥(MIC＞256 μg/ml)。ermX在其最早的宿主中呈誘導(dǎo)性表達(dá)[7],但本研究中所有攜帶ermX的分離株均對(duì)紅霉素高度耐藥,提示其為固有表達(dá),與歐洲和日本報(bào)道結(jié)果相似[6,8]。這8株分離株均從有紅霉素類或克林霉素類抗生素使用史的患者中分離,也可能是ermX固有表達(dá)的原因。

Tn5432轉(zhuǎn)座子最先報(bào)告見(jiàn)于Tauch等[7]報(bào)道,其由兩個(gè)拷貝的IS1249和紅霉素耐藥基因ermCX組成。2002年Ross報(bào)道在耐紅霉素的丙酸桿菌菌株中發(fā)現(xiàn)了全長(zhǎng)4 259 bp的Tn5432轉(zhuǎn)座子,其由兩個(gè)位于兩側(cè)的編碼轉(zhuǎn)座酶的IS1249序列、一個(gè)插入序列(ISCXI)和ermX基因構(gòu)成;攜帶Tn5432的丙酸桿菌(包括P.acnes、P.avidum、P.granulosum)對(duì)所有MLS類均高度耐藥[6]。2010年埃及也報(bào)道了由Tn5432轉(zhuǎn)座子中的ermX基因的插入導(dǎo)致了耐MLS類抗生素P.acnes[9],本研究中8株P(guān).acnes和2株P(guān).avidum攜帶的ermX序列與P.acnesermX具有100%的同源性;且10株分離株均檢測(cè)到與Tn5432序列一致的IS1249a和IS1249b,提示Tn5432轉(zhuǎn)座子已在中國(guó)出現(xiàn),且攜帶ermX進(jìn)入P.acnes中引起紅霉素耐藥。本研究是首次在國(guó)內(nèi)報(bào)道P.acnes攜帶ermX基因。

8株P(guān).avidum攜帶ermX(cj),其序列與基因庫(kù)中Corynebacterium jeikeium的ermX(cj)具有99%的同源性,而與P.acnesermX基因僅有94%的同源性,與從埃及痤瘡患者皮損中分離的P.acnes攜帶的ermX(cj)序列一致[9];且所有攜帶ermX(cj)的P.acnes和P.avidum分離株中均未檢測(cè)到IS1249a和IS1249b,提示ermX(cj)不是由Tn5432攜帶進(jìn)入丙酸桿菌,其是否通過(guò)其他轉(zhuǎn)座子進(jìn)入丙酸桿菌有待進(jìn)一步研究。本研究中,僅在P.avidum中檢測(cè)到ermX(cj),后者是否僅攜帶于P.avidum中或在丙酸桿菌中均存在,因本研究分離的耐藥菌株較少,尚待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。本研究在P.acnes和P.avidum中均檢測(cè)到位于Tn5432中的ermX基因,提示Tn5432通過(guò)不同途徑進(jìn)入丙酸桿菌的至少兩個(gè)種內(nèi),或在丙酸桿菌內(nèi)轉(zhuǎn)移。Tn5432是一個(gè)非融合性轉(zhuǎn)座子,其最初的宿主中位于攜帶多個(gè)耐藥基因的pPT10質(zhì)粒中[10],既往研究在攜帶Tn5432和ermX的丙酸桿菌中未發(fā)現(xiàn)pPT10質(zhì)粒存在的證據(jù),Tn5432是通過(guò)其他質(zhì)粒或整合到丙酸桿菌染色體中尚待研究。

大環(huán)類酯類和林可霉素類是治療痤瘡的常用抗生素,自從克林霉素和紅霉素外用制劑用于治療痤瘡后,耐紅霉素的P.acnes株在世界各地相繼出現(xiàn)[1-2,11],P.acnes的耐藥不斷增多,是抗生素治療痤瘡療效差或無(wú)效的主要原因。本研究表明,武漢市丙酸桿菌的耐藥由23S rRNA點(diǎn)突變和erm基因兩種不同的機(jī)制引起,前者提示丙酸桿菌面臨高強(qiáng)度的抗生素壓力,后者提示其他細(xì)菌攜帶的紅霉素耐藥基因已通過(guò)多種途徑傳入丙酸桿菌,值得臨床關(guān)注。

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2013-09-13)

(本文編輯:尚淑賢 吳曉初)

Erythromycin resistance in propionibacteria isolated from patients with acne in Wuhan city is associated with mutations in 23S rRNA gene and presence of erm genes

Zeng Xianyu*,Jiang Min,Fu Chen,Dong Bilin,Wu Zhuoxuan,Wang Weizhen.*Department of Dermatology,Wuhan First Hospital,Wuhan 430022,China

Wang Weizhen,Email:weizhenwang2007@aliyun.com

ObjectiveTo determine whether erythromycin-resistant propionibacteria isolated from patients with acne in Wuhan city harbor 23S rRNA gene mutations as well as the transposon Tn5432 carrying ermX genes.MethodsTwenty-ninePropionibacteriumstrains isolated from outpatients with acne in Wuhan city were included in this study.The E-test method was used to determine the susceptibility of these strains to erythromycin and clindamycin.PCR was performed to amplify the 23S rRNA,ermX,ermX(cj),IS1249a and IS1249b genes from resistant strains followed by DNA sequencing and nucleotide alignment.ResultsAmong the 29Propionibacteriumstrains,19 were identified asP.acnesand 10 asP.avidum.All of thesePropionibacteriumstrains were resistant to erythromycin(MIC ＞ 256 μg/ml)and clindamycin(MIC ＞ 256 μg/ml),except for 3P.acnesstrains sensitive to clindamycin.SevenP.acnesstrains resistant to both antibiotics exhibited an A→G transition at a position cognate withEscherichia coli23S rRNA 2058.An A→G transition at a position cognate withE.coli23S rRNA 2059 was identified in one clindamycin-resitant and three clindamycin-sensitiveP.acnesisolates.The ermX gene was found in the remaining 8P.acnesisolates and 2P.avidumisolates,with the sequence 100%identical to the reference sequence of the ermX gene ofP.acnesin Genbank.Meanwhile,the ermX(cj)gene was successfully amplified from the other 8P.avidumisolates,which showed 99%sequence homology with the ermX(cj)gene ofCorynebacterium jeikeium,but 94%homology with the ermX gene ofP.acnesin Genbank.Both IS1249a and IS1249b genes were amplified in the 10 ermX gene-positivePropionibacteriumstrains,but not in the other ermX gene-negative strains.ConclusionsThe erythromycin resistance inPropionibacteriumisolates from Wuhan city may be associated with the A→G transition at theE.coliequivalent bases 2058 and 2059 of the 23S rRNA gene,as well as the presence of the erm X(transferred through the transposon Tn5432)and ermX(cj)genes.

Propionibacterium;Erythromycin;Clindamycin;23S rRNA;Genes,erm

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.06.003

王瑋蓁,Email:weizhenwang2007@aliyun.com