溫斯健 吳飛云 林有坤 方玲

廣西壯族、漢族系統(tǒng)性紅斑狼瘡與Toll樣受體9基因多態(tài)性研究

溫斯健 吳飛云 林有坤 方玲

目的探討TLR9單核苷酸多態(tài)性與廣西系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者發(fā)病的相關性,以及其在壯族、漢兩個民族間的差異。方法聚合酶鏈反應-限制性酶切技術、聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性分析技術(PCR-RFLP)對97例廣西SLE患者和202例廣西健康對照者的TLR9基因多態(tài)性進行檢測,分析其基因型和等位基因頻率與SLE部分臨床實驗室指標的關聯(lián)性,并比較兩民族間的差異。結果TLR9 rs352140CC、CT、TT基因型頻率在漢族SLE組與漢族對照組中分別為42.9%、41.1%、16.1%和38.3%、55.8%、5.8%,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),其C、T等位基因頻率差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。TLR9rs352140 C/T基因型頻率和等位基因頻率在壯族SLE組與壯族健康對照組間、壯族SLE組與漢族SLE組間差異無統(tǒng)計學意義(均P＞0.05)。TLR9 rs352140TT基因型頻率在ds-DNA陽性組比陰性組高(P＜0.05),而T等位基因頻率在兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。TLR9 rs352140TT基因型頻率和T等位基因的頻率在SLEDAI≥9組比SLEDAI＜9組高,差異有統(tǒng)計學意義(均P＜0.05)。TLR9 rs352140TT基因型頻率和T等位基因的頻率在ANA陽性組與陰性組間差異無統(tǒng)計學意義(均P＞0.05)。結論TLR9 rs352140基因多態(tài)性可能與廣西漢族人SLE的易感性有關,TLR9基因多態(tài)性與部分SLE指標可能具有相關性。

紅斑狼瘡,系統(tǒng)性;Toll樣受體9;多態(tài)性,單核苷酸;壯族;漢族

作者單位:530021南寧,廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院皮膚性病科(溫斯健、吳飛云、林有坤);廣西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院細胞生物學與遺傳學教研室(方玲)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種自身免疫性疾病,發(fā)病機制迄今不明,免疫和遺傳在其發(fā)病中都起了重要作用[1]。隨著Toll樣受體(TLR)家族的發(fā)現(xiàn),天然免疫在SLE發(fā)生發(fā)展中的作用越來越受重視[2]。TLR與配體結合后激活天然免疫進而獲得特異性免疫,在兩者之間起橋梁作用,并參與免疫缺陷性疾病、異常免疫應答性疾病等的發(fā)病[3]。TLR9由于特異性識別非甲基化的CpG-DNA序列,在自身免疫性疾病中發(fā)揮作用[4]。本研究探討TLR9分子單核苷酸多態(tài)性與廣西SLE發(fā)病的相關性并比較兩民族間的差異。

對象與方法

一、對象

2010年5月至2013年1月廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院皮膚性病科住院的SLE患者97例,其中壯族41例,男5例,女36例,年齡11～60歲,平均(34.1±10.7)歲;漢族56例,男6例,女50例,年齡9～72歲,平均(34.4±12.2)歲。所有患者均符合美國風濕病協(xié)會1997年修訂的SLE診斷標準[5],首次診斷而住院,入院前從未用糖皮質激素、免疫抑制劑、免疫調節(jié)劑等,未合并其他結締組織病、腫瘤、糖尿病等系統(tǒng)性疾病。對照組202例為同期在本院健康體檢者。其中壯族82例,男8例,女74例,年齡15～60歲,平均(33.1±10.1)歲;漢族120例,男15例,女105例,年齡12～68歲,平均(36.6±10.8)歲。以上均為廣西籍人且3代內均為純壯族或漢族血統(tǒng),相互間無親緣關系。各組間在性別、年齡比例上均衡可比(均P＞0.05)。本研究獲醫(yī)院倫理委員會批準,均簽署知情同意書。

二、方法

1.標本采集及基因組DNA提取:采集各對象外周靜脈血2 ml置于EDTA抗凝管中,按DP1802全血基因組DNA快速提取試劑盒(離心柱型,帶蛋白酶K,北京Bioteke公司)說明書提取白細胞基因組DNA,-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.引物設計:參照GenBank中TLR9基因的引物序列運用primer5.0設計引物,由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物的核苷酸序列上游引物5'-AAAGAAGGCCAGGTAATTGTCA-3';下游引物5'-TGCTAGACCTGTCCCACAATAA-3'。擴增產(chǎn)物長度431 bp,引物的退火溫度為58℃。PCR反應:按照BioTeke的2×Power Taq PCR MasterMix試劑盒說明書操作。PCR反應體系如下:2×MasterMix 25 μl,上、下游引物各 2 μl,模板 6 μl,補雙蒸水15 μl至總體積50 μl。在德國Biometra公司梯度PCR儀進行循環(huán),反應參數(shù):預變性95℃3min;變性95℃ 30 s;退火58℃ 30 s;延伸72℃ 45 s,總共35個循環(huán),最后延伸72℃ 10min。

3.限制性酶切反應及限制性片段長度多態(tài)性分析:用限制性核酸內切酶Bsh1236I(BstUI)對PCR產(chǎn)物進行酶切。酶切反應體系如下:無核酸酶水9 μl,10 × 緩沖液 1 μl,Bsh1236I 1 μl,PCR 擴增產(chǎn)物 5 μl。輕輕混勻并置于37℃恒溫水浴箱中酶切至少4 h。酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,根據(jù)凝膠成像結果,隨機抽取酶切成1、2、3條條帶的樣本各10個,將其PCR產(chǎn)物送上海英駿生物技術有限公司廣州分公司進行序列測定,結果回報后使用Chromas軟件打開DNA序列并讀取和記錄。

4.統(tǒng)計學處理:計算各組基因型和等位基因頻率,數(shù)據(jù)輸入SPSS16.0軟件包,然后確認其是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。多態(tài)性位點基因型頻率和等位基因頻率比較采用χ2檢驗和校正χ2檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

TLR9基因的PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖,可見到明亮的、單一的431 bp的目的基因條帶,沒有非特異性擴增產(chǎn)物,見圖1。

圖1 TLR9基因PCR產(chǎn)物電泳圖1～4,6～8:DNA PCR 431 bp目的條帶;5:空白對照;M:標準參照物

二、PCR產(chǎn)物的限制性酶切的電泳結果

根據(jù)酶切圖譜知限制性核酸內切酶Bsh1236I(BstUI) 特異酶切序列為5'…CGCG…3'和3'…GCGC…5'。TLR9 rs352140存在多態(tài)性,其擴增產(chǎn)物經(jīng)限制性核酸內切酶酶切后:CC基因型可以被Bsh1236I(BstUI)酶切,產(chǎn)生371 bp和60 bp 2條帶;TT基因型不能被酶切,只有431 bp 1條帶;CT雜合子可見431 bp、371 bp和60 bp 3條帶。TLR9 rs352140酶切產(chǎn)物電泳圖見圖2。

圖2 TLR9rs352140 C/T酶切圖譜 1、6、8:CC 基因型;3、5、7、10:CT基因型;9:TT基因型;2;空白對照組;4:標準參照物

三、PCR擴增產(chǎn)物測序結果

TLR9 rs352140C/C、C/T、T/T 基因型擴增產(chǎn)物測序圖分別見圖3～5。

圖3 TLR9rs352140C/C基因型擴增產(chǎn)物測序圖(下劃線為C等位基因)

圖4 TLR9rs352140C/T基因型擴增產(chǎn)物測序圖(下劃線為C/T雜合子)

圖5 TLR9rs352140T/T基因型擴增產(chǎn)物測序圖(下劃線為T等位基因)

四、TLR9rs352140C/T多態(tài)性與廣西壯族、漢族SLE的相關性分析

經(jīng)卡方檢驗,SLE組和對照組TLR-9基因rs352140C/T等位基因頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律,說明群體基因遺傳平衡,數(shù)據(jù)來自同一蒙德爾群體(P＞0.05)。從表1可以看到,TLR9rs352140基因型及等位基因頻率在SLE組與對照組間,差異無統(tǒng)計學意義(均P＞0.05)。進一步按壯族、漢族進行分組后發(fā)現(xiàn),TLR9 rs352140CC、CT、TT基因型頻率在漢族SLE組與漢族對照組中分別為42.9%、41.1%、16.1%和38.3%、55.8%、5.8%,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.044),其C、T等位基因頻率差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。TLR9rs352140 C/T基因型頻率和等位基因頻率在壯族SLE組與壯族對照組間、壯族SLE組與漢族SLE組間差異無統(tǒng)計學意義(均P＞0.05),見表2。

表1 TLR9rs352140基因型及等位基因頻率與廣西SLE組及對照組的差異性比較分析[例(%)]

表2 TLR9rs352140C/T基因型及等位基因頻率與廣西壯族、漢族SLE的相關性分析[例(%)]

五、TLR9 rs352140 C/T多態(tài)性位點與廣西SLE患者的臨床及實驗室指標的比較分析

表3 TLR9 rs352140C/T多態(tài)性位點與廣西SLE部分指標的比較分析[例(%)]

表3顯示了TLR9 rs352140的基因型頻率和等位基因頻率與97例SLE患者按ds-DNA陽性與陰性、ANA陽性與陰性、SLEDAI≥9分與＜9進行分組后的比較分析情況。在校正了性別、年齡等混雜因素后,χ2檢驗結果顯示,TLR9 rs352140 TT基因型頻率在ds-DNA陽性組比陰性組高(P＜0.05),而T等位基因頻率在兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。TLR9 rs352140 TT基因型頻率和T等位基因的頻率在SLEDAI≥9組比SLEDAI＜9組高,差異有統(tǒng)計學意義(均P＜0.05)。TLR9 rs352140 TT基因型頻率和T等位基因的頻率在ANA陽性組與ANA陰性組間,差異無統(tǒng)計學意義(均P＞0.05)。

討 論

近年來研究表明,TLR9在天然免疫和體內抗體的形成中起重要作用。Ichikawa等[6]研究表明,TLR9可以與細菌CpG基序結合,進而激活抗原提呈細胞識別細菌和自身抗原,打破自身免疫耐受。最近有研究表明,不僅病原微生物的CpG DNA可以被TLR9識別,而且哺乳動物本身的內源性配體,即低甲基化核酸序列也可以被TLR9識別。SLE患者的DNA甲基化酶活性降低,引起DNA低甲基化增多,同時還因為患者細胞凋亡增加,從而使患者血清中低甲基化的DNA升高。這些低甲基化的DNA就可以與TLR9結合,誘導機體產(chǎn)生抗dsDNA抗體。劉慧敏等[7]研究發(fā)現(xiàn),抗dsDNA抗體的產(chǎn)生需TLR9參與,用氯喹阻斷TLR9 CpG DNA信號傳導路徑后,抗dsDNA抗體的產(chǎn)生明顯下降。

TLR9存在基因多態(tài)性。宋衛(wèi)青等[8]報道,TLR9 rs187084C/T基因型頻率和等位基因頻率與漢族人群SLE無關,但發(fā)現(xiàn)TLR9基因表達增高。Xu等[9]發(fā)現(xiàn),TLR9 rs352140的多態(tài)性可能與SLE的易感性有關。日本[10]、丹麥[11]等學者發(fā)現(xiàn),TLR9多個位點的基因多態(tài)性與SLE易感性有關,TT基因型頻率在SLE組較正常組高。本研究發(fā)現(xiàn),TLR9 rs352140基因多態(tài)性在漢族SLE患者與漢族健康對照者間存在差異,TT基因型頻率在漢族SLE患者比漢族健康對照者高,但在壯族、漢族SLE患者間,壯族SLE患者與壯族健康者間,以及壯族、漢族正常人之間不存在差異,提示TLR9 rs352140TT基因型有可能是廣西漢族SLE的危險基因型,與上述研究結果類似。研究還顯示,SLE組中TLR9 rs352140TT基因型頻率和(或)T等位基因頻率與抗dsDNA抗體陽性、SLEDAI等SLE活動指標之間存在具有統(tǒng)計學意義的關聯(lián)性,提示TLR9有可能介導SLE疾病活動性。人TLR9基因位于第3號染色體(3p21.3)上,含有兩個外顯子,第2個外顯子為主要編碼區(qū)域,rs352140位點就位于第2個外顯子上,該位點突變可能會增強TLR9的表達和功能,并通過其連鎖基因增強基因表達而增加SLE易感性,使得dsDNA抗體的產(chǎn)生增加,并進一步影響SLE的活動度。但這種相關性是否僅由漢族患者所引起,由于病例數(shù)偏少未能分組進行統(tǒng)計分析而未能明確。

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2013-11-26)

(本文編輯:吳曉初)

Associations between Toll-like receptor 9 gene polymorphisms and systemic lupus erythematosus in Guangxi Zhuang and Han populations

Wen Sijian*,Wu Feiyun,Lin Youkun,Fang Ling.*Department of Dermatology and Venereology,First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021,China

Lin Youkun,Email:linyoukun7@aliyun.com

ObjectiveTo assess the association between Toll-like receptor 9(TLR9)gene single nucleotide polymorphisms(SNPs)and systemic lupus erythematosus(SLE)development in Guangxi Zhuang and Han populations,as well as the difference in TLR9 SNPs between the two populations.MethodsTotally,41 SLE patients of Zhuang nationality and 56 of Han nationality,as well as 82 healthy checkup examinees of Zhuang nationality and 120 of Han nationality were enrolled in this study.Venous blood samples were obtained from all of these subjects and subjected to DNA extraction.The single nucleotide polymorphisms in TLR9 gene were detected by PCR-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP)analysis followed by direct sequencing.Chi-square test and adjusted Chi-square test were conducted to assess the relationship between the genotype and allele frequencies of TLR9 SNPs and some clinical and laboratory parameters of patients with SLE,as well as the differences in genotype and allele frequencies of TLR9 SNPs between the two populations.ResultsThe frequencies of CC,CT and TT genotypes of TLR9 SNP rs352140 were 42.9%,41.1%and 16.1%respectively in the patients of Han nationality,compared to 38.3%,55.8%and 5.8%in the healthy controls of Han nationality(allP＜0.05),but no significant difference was observed in the frequency of C or T allele of the SNP rs352140 between the patients and controls of Han nationality(bothP＞0.05).There was no significant difference in the genotype or allele frequency of TLR9 SNP rs352140 between the patients and healthy controls of Zhuang nationality,or between the patients of Han nationality and Zhuang nationality(allP＞0.05).The patients with anti-dsDNA antibodies showed a significantly higher frequency of TT genotype(P＜0.05),but similar T allele frequency at TLR9 SNP rs352140(P＞0.05)compared with those without.The frequencies of both TT genotype and T allele of TLR9 SNP rs352140 were significantly increased in the patients with a SLE disease activity index(SLEDAI)≥9 compared with those with a SLEDAI＜9(bothP＜0.05).There was no statistical difference in either the TT genotype or the T allele frequency at TLR9 SNP rs352140 between antinuclear antibody-positive and-negative patients with SLE(bothP＞0.05).ConclusionsThe TLR9 SNP rs352140 is correlated with several clinical and laboratory parameters of SLE,and might contribute to the susceptibility to SLE in Guangxi Han population.

Lupus erythematosus,systemic;Toll-like receptor 9;Polymorphism,single nucleotide;Zhuang nationality;Han nationality

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.06.008

廣西自然科學基金(2010GXNSFA013186)

林有坤,Email:linyoukun7@aliyun.com