李培培 ，謝禮，薛進(jìn)，3，羊健，李靜，嚴(yán)成其，張恒木，陳劍平

1.浙江師范大學(xué) 生化學(xué)院，浙江 金華 321000；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 省部共建國家重點實驗室培育基地，農(nóng)業(yè)部植物保護(hù)與生物技術(shù)重點實驗室，浙江省植物病毒重點實驗室，浙江 杭州 310021；3.植物疾病控制與利用湖南省高校重點實驗室，植物病蟲害生物學(xué)與防控湖南省重點實驗室，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南 長沙 410128

肌動蛋白是真核生物中普遍存在的一種結(jié)構(gòu)蛋白，具有高度的保守性[1]。植物肌動蛋白是一種單一的多肽鏈球狀蛋白，由375～377 個氨基酸殘基組成，其相對分子質(zhì)量約為42×103[2]。根據(jù)肌動蛋白等電點的不同，可將其分為3類：α-肌動蛋白主要分布于各種肌肉細(xì)胞中，β-肌動蛋白與γ-肌動蛋白主要分布于肌細(xì)胞和非肌細(xì)胞中。β-肌動蛋白與γ-肌動蛋白是不同類型的細(xì)胞中最為豐富的蛋白質(zhì)，一方面在維持和調(diào)節(jié)細(xì)胞基質(zhì)的結(jié)構(gòu)中起關(guān)鍵作用；另一方面，它們還是非肌肉細(xì)胞化學(xué)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的重要組成部分，并與肌動蛋白結(jié)合蛋白共同參與細(xì)胞的各種生理活動，如易位及細(xì)胞形態(tài)的改變[3]。

β-肌動蛋白是主要的細(xì)胞骨架蛋白，在真核細(xì)胞中有至關(guān)重要的作用[4]。該蛋白高度保守，并常被用作“內(nèi)參基因”[5]。β-肌動蛋白以螺旋的方式聚合成肌動蛋白絲（或微絲），構(gòu)成真核細(xì)胞三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)骨架，為細(xì)胞提供機械支持并決定細(xì)胞的形態(tài)。此外，β-肌動蛋白還參與許多細(xì)胞生理過程，包括細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移或移動、細(xì)胞分裂、胞質(zhì)分裂、胞吞/胞吐作用、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、mRNA 定位和轉(zhuǎn)錄等[6]。近期的研究表明，β-肌動蛋白可以通過與熱激蛋白90相互作用來調(diào)節(jié)血小板一氧化氮合酶3 的活性[7]。有報道β-肌動蛋白與病毒的增殖和裝配有關(guān)，當(dāng)β-肌動蛋白受到細(xì)胞松弛素D（一種肌動蛋白聚合抑制劑）的干擾時，傳染性支氣管炎病毒粒子的裝配和出芽會被阻斷[8]。用肌動蛋白抑制劑處理細(xì)胞時，可以在滲透部位看到細(xì)胞的防御反應(yīng)，如細(xì)胞質(zhì)聚集、核運動、形成乳突及過敏性細(xì)胞死亡[9-12]。Song 等[13]的研究表明，肌動蛋白細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)及肌動蛋白結(jié)合蛋白在由小麥條銹菌引起的小麥條銹病的防御反應(yīng)中有重要作用。

以植物肌動蛋白為主形成的動態(tài)微絲骨架系統(tǒng)已成為植物細(xì)胞生物學(xué)研究領(lǐng)域的熱點之一[9]。有關(guān)植物肌動蛋白基因家族的研究比較透徹的是擬南芥（Arabidopsis thaliana）。擬南芥的肌動蛋白家族包含10 個肌動蛋白基因（actin genes，ACT），其中8個編碼的功能蛋白ACT1/3/4/11/12 與生殖生長相關(guān)，ACT2/7/8 與營養(yǎng)生長相關(guān)，另外2 個（ACT5與ACT9）有可能是假基因[14]。在水稻中已克隆出很多肌動蛋白基因，但有關(guān)其功能與定位的研究報道還很少。我們克隆了一個水稻β-肌動蛋白基因，并利用膠體金免疫電鏡技術(shù)對β-肌動蛋白在水稻細(xì)胞內(nèi)的分布情況進(jìn)行了詳細(xì)觀察和描述，為進(jìn)一步研究肌動蛋白的功能提供亞細(xì)胞定位的依據(jù)，同時也為維管束細(xì)胞學(xué)的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

日本晴水稻（Oryza sativaL.ssp.japonicacv.Nipponbare）樣品采自浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗大田內(nèi)；大腸桿菌Trans1-T1 感受態(tài)細(xì)胞、克隆載體pEASY-T5 Zero Cloning Vector 均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司（TransGen Biotech）；TRIzol 試劑、SuperScriptⅢReverse Transcriptase 試劑盒均為Invitrogen 公司產(chǎn)品；RNase 抑制劑、dNTP Mix、ExTaqDNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶等購自TaKaRa 公司；凝膠純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均為Promega公司產(chǎn)品；肌動蛋白鼠單抗購自Agrisera 公司，該抗體針對擬南芥肌動蛋白制備，經(jīng)公司驗證其對水稻肌動蛋白呈陽性反應(yīng)；膠體金二抗（10 nm 羊抗鼠的IgG 抗體）購自Sigma 公司；克隆肌動蛋白特異引物與oligo-dT 通用引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成；其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純以上產(chǎn)品。

1.2 cDNA的獲得

用TRIzol 法提取水稻葉片組織的總RNA[15]。采用Invitrogen 公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。取總RNA 2 μg、oligo-dT 1 μL、10 mmol/L dNTP Mix 1 μL，用DEPC 水補足13 μL，65℃變性5 min 后，置冰上至少1 min，隨后加入5×第一鏈緩沖液4.0 μL、0.1 mol/L DTT 1 μL、40 U/μL RNA 酶抑制劑1 μL、SuperscriptⅢ逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL，組成20 μL 體系，42℃反應(yīng)10 min，55℃反應(yīng)1 h，70℃處理15 min，將制備好的cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 基因的擴增與鑒定

取cDNA 2 μL、20 μmol/L 上游引物Actin-F（5'-ATGGCTGATTCTGAGGATATTCA-3'）與下游引物Actin-R（5'-TTAGAAGCATTTTCTATGTACAAT G-3'）各0.6 μL、10×EXTaq緩沖液5 μL、2.5 mmol/L dNTP Mix 4 μL、5 U/μL ExTaqDNA 聚合酶0.5 μL，加ddH2O 補足50 μL 體系，然后運行以下PCR 程序：94℃5 min，94℃30 s，60℃40 s，72℃90 s，35 個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后繼續(xù)反應(yīng)10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳（1×TAE 電泳緩沖液、180 V 電壓）檢測PCR擴增產(chǎn)物，并對目的基因片段進(jìn)行切膠回收并純化。將純化的目的基因片段通過T-A克隆的方法連接到pEASY-T5 Zero 克隆載體上，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Tran1-T1 感受態(tài)細(xì)胞，PCR 篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒后進(jìn)行測序分析。

1.4 樣品固定聚合和切片

取新鮮水稻葉片，避開葉脈將其切成1 mm×3 mm 的小片，用0.1 mol/L 哌 嗪-1，4-二乙磺 酸（PIPES，pH7.0）配制的4%多聚甲醛于4℃抽真空固定2 h，經(jīng)0.1 mol/L PIPES（pH7.0）緩沖液洗滌3 次后，在4℃條件下依次用30%、50%乙醇脫水，-20℃條件下依次用50%、70%、90%、100%、100%、100%乙醇脫水，-20℃條件下依次用30%、70%的用乙醇配置的K4M 包埋劑各滲透3 h，100%純K4M 包埋劑充分滲透6 h后將樣品浸入K4M 包埋劑，置-20℃冰箱中紫外照射聚合72 h，常溫紫外聚合48 h，得到聚合完畢的包埋塊。將樣品包埋塊在Leica UC6 型切片機上切片，厚度70～90 nm，收集于鎳網(wǎng)上進(jìn)行免疫膠體金標(biāo)記。

1.5 免疫膠體金標(biāo)記

將帶有切片的鎳網(wǎng)用BL 封閉液（PBS 緩沖液配置，含1%的BSA、0.02%的PEG20000）于28℃封閉30 min，去離子水漂洗3 次；一抗孵育采用BL 封閉液1∶50 稀釋的肌動蛋白抗體，28℃孵育3 h；去離子水漂洗3 次；二抗孵育采用BL 封閉液1∶100 稀釋的羊抗鼠膠體金（直徑10 nm），28℃孵育2 h；去離子水洗滌3 次，晾干。采用未免疫的血清作為一抗孵育的陰性對照。帶有樣品切片的鎳網(wǎng)經(jīng)醋酸雙氧鈾（C4H6O6U·2H2O）和檸檬酸鉛（C6H5O7Pb）染液雙染色各15 min 后，用H7650 型透射電鏡（日立公司）觀察，加速電壓為80 kV，采用Gatan830 型CCD 相機（美國Gatan公司）照相。

2 結(jié)果

2.1 OsActin的克隆與鑒定

以cDNA 為模板，用特異引物Actin-F/Actin-R進(jìn)行PCR 擴增，瓊脂糖凝膠電泳顯示擴增片段與預(yù)期1134 bp 大小一致（圖1）。將所得片段回收純化后，連接至pEASY-T5 Zero 載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1，挑取若干單克隆進(jìn)行PCR 擴增鑒定，電泳檢測發(fā)現(xiàn)1～3 號與預(yù)期大小一致為陽性克?。▓D2），對陽性克隆提取質(zhì)粒，測序獲得水稻肌動蛋白基因序列，命名為OsActin。

2.2 OsActin的分子進(jìn)化分析

為了進(jìn)一步研究克隆得到的OsActin與水稻、擬南芥肌動蛋白基因家族的進(jìn)化關(guān)系，在GenBank 數(shù)據(jù)庫中下載了部分?jǐn)M南芥與水稻肌動蛋白的氨基酸序列，利用BioEdit 與MEGA 軟件對其進(jìn)行比對分析并構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，OsActin 與OsRAc1（GenBank 登錄號：X15865）、擬南芥ACT11（GenBank 登錄號：U27981）的同源性分別高達(dá)98%與97%。從圖3 可以看出，OsActin 和擬南芥與生殖生長相關(guān)的肌動蛋白ACT1、ACT3、ACT4、ACT11、ACT12 聚集成簇，推測該基因可能也參與調(diào)節(jié)水稻的生殖生長。

圖1 OsActin目的基因的PCR擴增

圖2 pEASY-T5 Zero-OsActin克隆的PCR鑒定

2.3 水稻肌動蛋白基因的亞細(xì)胞定位分析

由于葉肉細(xì)胞等細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)較多，也可能會干擾觀察，因此我們選用液泡較多細(xì)胞質(zhì)較少的維管束薄壁細(xì)胞作為研究對象。利用膠體金免疫電鏡定位技術(shù)對水稻維管束薄壁細(xì)胞（parenchyma cells of vascular bundle）中的肌動蛋白進(jìn)行定位研究，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中均有大量特異性膠體金顆粒標(biāo)記，而在液泡中及細(xì)胞壁上都沒有觀測到特異性膠體金顆粒標(biāo)記（圖4）。

3 討論

高等植物細(xì)胞都含有一個復(fù)雜的細(xì)胞結(jié)構(gòu)骨架，該結(jié)構(gòu)是由具有高度動態(tài)性和嚴(yán)密調(diào)節(jié)作用的微絲組成的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。細(xì)胞定位及一些生理生化研究表明肌動蛋白是植物細(xì)胞骨架的基本組成部分，在植物的生長、發(fā)育以及對逆境脅迫的響應(yīng)中起重要作用[16-18]。例如由肌動蛋白與肌球蛋白相互作用組成的肌動球蛋白系統(tǒng)驅(qū)動著細(xì)胞質(zhì)流動，還參與了細(xì)胞的有絲分裂、細(xì)胞器運動、頂端生長、對重力的感應(yīng)、細(xì)胞形狀的控制及葉綠體的流動等。因此，對于肌動蛋白的研究具有重要意義。

圖3 基于水稻與擬南芥肌動蛋白氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖4 肌動蛋白在水稻維管束薄壁細(xì)胞中的定位

在本研究中，我們克隆得到水稻的一個β-肌動蛋白基因，分子進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白與水稻OsRAc1 及擬南芥ACT11 的氨基酸同源性分別為98%和97%。擬南芥ACT11 及與其同源的ACT1、ACT3、ACT4 和ACT12 在花粉中均有表達(dá)，因此將它們指定為生殖型肌動蛋白。不同的是，ACT11 在幼小組織、花器官原基、新生花蕾、胚珠及成熟的花粉中優(yōu)先表達(dá)，并且是惟一在胚乳和胚發(fā)育過程中顯著表達(dá)的肌動蛋白，它在生殖器官中獨特的表達(dá)模式表明，ACT11 對于擬南芥的生殖發(fā)育是必不可少的[19]。OsActin 與擬南芥的ACT11 高度同源，暗示其對水稻的生殖發(fā)育也具有重要的作用。對OsActin的亞細(xì)胞定位研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白在水稻薄壁細(xì)胞的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中均有分布，為進(jìn)一步研究該基因在水稻生長發(fā)育過程中的作用及其超分子結(jié)構(gòu)提供了依據(jù)。

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