朱軍保，王丹，汪文倫，許萬云，高劍峰

石河子大學 生命科學學院，新疆 石河子 832000

微藻是地球上最早出現(xiàn)的生命類群，是一類可利用光合作用的低等植物，一般為單細胞結(jié)構(gòu)，呈群體或絲狀，種類繁多，分布極其廣泛，在海洋、淡水湖泊、樹干、潮濕的土壤、干燥的沙漠，只要有光和潮濕的地方都有藻類的身影[1-3]。沙漠中藻類的分布也極其廣泛，其中大多數(shù)為綠藻和藍藻。沙漠小球藻就是生長在沙漠中的綠藻。這些藻類生長在干旱半干旱區(qū)，地面完全被沙所覆蓋，植物稀少，雨水缺乏，空氣干燥，環(huán)境極其惡劣[4]?？梢哉f，沙漠小球藻是綠藻門中具有極強生命力的一類微藻。

小球藻是比較經(jīng)濟型的綠色單細胞植物，細胞形態(tài)為橢圓形或圓形，直徑為2～12 μm，細胞壁一般較薄，少數(shù)堅固，有時會分泌黏質(zhì)使其多個細胞黏在一起，人們用肉眼很難看到，需要借助顯微鏡進行辨別[5]。小球藻由于其生態(tài)分布廣，繁殖速度快，培養(yǎng)簡便，廉價等特點，是用于生物技術(shù)及生物質(zhì)能源研究的理想材料，而利用基因工程技術(shù)研究小球藻是微藻生物技術(shù)的一個重要分支。在小球藻基因工程中，最為重要的環(huán)節(jié)是選擇合適的選擇標記基因。迄今在小球藻基因工程中確定選擇標記基因的最常用方法有2 種，一種方法是抗生素篩選法，另一種是代謝突變補償方法[6]。將抗性基因和目的基因同時轉(zhuǎn)入被轉(zhuǎn)化的藻細胞中，并且在含有抗性的培養(yǎng)基中篩選出陽性克隆，即為抗生素法選擇標記基因。

我們運用微藻在液體培養(yǎng)過程中藻液顏色變化、血球板細胞計數(shù)和藻細胞固體平板培養(yǎng)的方法，系統(tǒng)性研究了4 株沙漠小球藻對幾種基因工程中常用抗生素的敏感性，以期為今后的沙漠小球藻基因工程研究提供實驗基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

4 株沙漠小球藻均由本實驗室從新疆沙漠沙樣中分離鑒定，其中GTD8A1、GTD4A-1 和GTD7C-2分離自古爾班通古特沙漠，TLD6B 分離自塔克拉瑪干沙漠[7-8]。

5 種抗生素均購自北京索萊寶科技有限公司，抗生素母液的配制參照《分子克隆實驗指南》[9]。各抗生素儲存液質(zhì)量濃度為：氨芐西林（Ap）100 mg/mL，頭孢霉素（Cef）50 mg/mL，卡那霉素（Km）50 mg/mL，氯霉素（Cm）50 mg/mL，鏈霉素（St）50 mg/mL。其中氯霉素用無水乙醇配制成母液，其他抗生素溶液均用無菌蒸餾水配制；采用0.22 μm 濾膜過濾除菌，貯存于-20℃冰箱中。

藻種所用的BBM 培養(yǎng)基[10]：NaNO3250 mg/L，KH2PO4175 mg/L，K2HPO475 mg/L，MgSO4·7H2O 75 mg/L，CaCl2·2H2O 25 mg/L，NaCl 25 mg/L，EDTA 50 mg/L，KOH 31 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 4.98 mg/L，H3PO411.42 mg/L，ZnSO4·7H2O 8.82 mg/L，MnCl21.44 mg/L，MnO30.71 mg/L，CaSO4·5H2O 1.57 mg/L，Co（NO3）2·6H2O 0.49 mg/L，98% H2SO42 μL/L（可在以上組分中加入15～20 g 瓊脂，加入蒸餾水補至1 L 制成固體培養(yǎng)基，121℃滅菌20 min，4℃保存）。

LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L（加去離子水溶解至終體積1 L，用1 mol/L NaOH 調(diào)pH 值為7.0～7.4，同時加入15～20 g瓊脂粉，制成固體培養(yǎng)基，121℃滅菌20 min）。

1.2 藻細胞的預培養(yǎng)

將分離純化的4 株沙漠小球藻按相同濃度接種于含有BBM 培養(yǎng)基的三角瓶中，在光照度為2500 lx、光暗周期12 h/12 h、溫度為23℃的條件下在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，15～20 d為1個周期。

1.3 4株沙漠小球藻對5種抗生素的敏感性測定

分別取經(jīng)活化后培養(yǎng)至對數(shù)生長期的藻種GTD8A1、GTD4A-1、GTD7C-2 和TLD6B（相同濃度）0.5 mL 加入六孔板中，再加入相應的不同濃度的抗生素（表1）及5 mL BBM 液體培養(yǎng)基，抗生素濃度由多次預試驗確定，每個濃度設(shè)立2 個平行觀察培養(yǎng)，并設(shè)置對照組（不添加任何抗生素）同時比對各藻液顏色變化，每24 h用血球計數(shù)板計數(shù)1次，連續(xù)計數(shù)7 d。

血球計數(shù)板測定方法：每次取50 μL藻液，用碘液（稱取13 g 碘及35 g 碘化鉀，溶于100 mL 水中，稀釋定容至1000 mL，搖勻，貯存于棕色瓶中）固定，用血球計數(shù)板在光學顯微鏡下測定藻細胞密度[11]。

2 結(jié)果

2.1 不同抗生素對沙漠小球藻生長狀況的影響

2.1.1 對GTD8A1 生長狀況的影響 圖1 是GTD8A1 經(jīng)不同抗生素不同濃度梯度處理后培養(yǎng)至第7 d 時與未加抗生素的藻液培養(yǎng)至第7 d 時的藻細胞數(shù)差值，柱圖在橫軸上方表明抗生素促進了藻細胞的生長，反之則抑制了藻細胞的生長。由圖可知，氨芐西林在一定的濃度梯度內(nèi)具有促進GTD8A1 生長的作用，且在100～800 μg/mL 濃度內(nèi)，隨著氨芐西林濃度的升高，其促進生長的作用越來越明顯。頭孢霉素相對于氨芐西林促進GTD8A1 生長的作用更為強烈，濃度為400 μg/mL 時對GTD8A1 生長的促進作用最為明顯，7 d 時的細胞密度為空白對照組的2 倍。鏡檢氨芐西林和頭孢霉素在以上濃度范圍內(nèi)的藻液，發(fā)現(xiàn)二細胞較多，可見在一定濃度范圍內(nèi)氨芐西林和頭孢霉素促進了GTD8A1 的分裂繁殖，而當氨芐西林濃度達到1000 μg/mL、頭孢霉素濃度達到800 μg/mL 時，二者對藻細胞的生長才有明顯的抑制作用。而卡那霉素、氯霉素和鏈霉素在所設(shè)濃度梯度范圍內(nèi)對GTD8A1 的生長都有較為明顯的抑制作用，在所設(shè)最低濃度25 μg/mL 時就已經(jīng)表現(xiàn)出了對藻細胞生長的抑制作用，且隨著抗生素濃度的增加，對GTD8A1 生長的抑制作用越來越明顯，沒有促進藻細胞的生長。比較這3種抗生素對GTD8A1生長的抑制作用，可發(fā)現(xiàn)氯霉素的抑制作用遠遠低于鏈霉素，卡那霉素的抑制作用則介于氯霉素與鏈霉素之間。因此，高濃度的頭孢霉素適用于實驗室大規(guī)?；囵B(yǎng)GTD8A1；做基礎(chǔ)無菌培養(yǎng)時，可選擇對GTD8A1 生長影響最小的低濃度氨芐西林作為抑菌劑；而鏈霉素和卡那霉素可作為GTD8A1 藻細胞基因工程遺傳轉(zhuǎn)化的選擇標記。

表1 5種抗生素的濃度梯度（μg/mL）

圖1 5種抗生素不同濃度梯度與未加抗生素作用下培養(yǎng)至第7 d時GTD8A1的細胞計數(shù)差值

2.1.2 對GTD4A-1 生長狀況的影響 圖2 是GTD4A-1 經(jīng)不同抗生素不同濃度梯度處理后培養(yǎng)至第7 d 時與未加抗生素的藻液培養(yǎng)至第7 d 時的藻細胞數(shù)差值。由圖可知，氨芐西林在一定的濃度梯度內(nèi)具有促進GTD4A-1 生長的作用，且在100～800 μg/mL 濃度梯度內(nèi)，隨著氨芐西林濃度的升高，其促進生長的作用越來越明顯，在7 d 時，氨芐西林濃度為800 μg/mL 的藻細胞密度約為未加氨芐西林細胞密度的1.5 倍，而低濃度的氨芐西林（如濃度為100 μg/mL）對GTD4A-1 的生長影響不大，高濃度（1000 μg/mL）的氨芐西林抑制GTD4A-1 的生長。低濃度的頭孢霉素對GTD4A-1 具有較強的生長促進作用，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著頭孢霉素濃度的升高，這種促進作用逐漸降低，濃度為800 μg/mL 時抑制GTD4A-1 生長的作用最為明顯；濃度為50 μg/mL 時促進GTD4A-1生長的作用最為明顯，7 d時細胞密度為空白對照的3 倍多。低濃度的氯霉素對GTD4A-1 的影響不大，具有一定的抑菌性，高濃度的氯霉素對GTD4A-1 的生長具有較強的抑制作用。鏈霉素、卡那霉素對GTD4A-1的生長具有明顯的抑制作用，在所設(shè)最低濃度25 μg/mL 時對GTD4A-1 的生長就表現(xiàn)出抑制作用，且隨著濃度的增加，對GTD4A-1 的抑制作用越來越明顯。因此，在制備無菌藻液時可選用適當濃度的氨芐西林、頭孢霉素或氯霉素作為抑菌劑，而卡那霉素和鏈霉素可作為GTD4A-1 藻細胞基因工程遺傳轉(zhuǎn)化的選擇標記。

圖2 5種抗生素不同濃度梯度與未加抗生素作用下培養(yǎng)至第7 d時GTD4A-1的細胞計數(shù)差值

2.1.3 對GTD7C-2 生長狀況的影響 圖3 是GTD7C-2 經(jīng)不同抗生素不同濃度梯度處理后培養(yǎng)至第7 d 時與未加抗生素的藻液培養(yǎng)至第7 d 時的藻細胞數(shù)差值。由圖可知，5 種抗生素在所設(shè)的梯度范圍內(nèi)對GTD7C-2 的生長均具有不同程度的抑制作用。低濃度的氨芐西林對GTD7C-2 生長的抑制作用不太顯著，高濃度則抑制GTD7C-2 的生長，總體來講，隨著氨芐西林濃度的增加，其對藻細胞生長的抑制作用越來越強，當濃度達到最大1000 μg/mL 時，對GTD7C-2 生長的抑制作用最強。低濃度的頭孢霉素對GTD7C-2 的生長影響不大，在所設(shè)的最高濃度800 μg/mL 時對GTD7C-2 的生長才有強烈的抑制作用。卡那霉素、氯霉素和鏈霉素對GTD7C-2 的生長抑制作用較為明顯，在所設(shè)最低濃度25 μg/mL 時就表現(xiàn)出很強的敏感性，不過在所設(shè)濃度梯度內(nèi)對GTD7C-2 生長的這種抑制作用沒有太大變化。因此，在制備無菌藻液時可選用適當濃度的氨芐西林和頭孢霉素作為抑菌劑，而卡那霉素、氯霉素和鏈霉素可作為GTD7C-2 藻細胞基因工程遺傳轉(zhuǎn)化中的選擇標記。

圖3 5種抗生素不同濃度梯度與未加抗生素作用下培養(yǎng)至第7 d時GTD7C-2的細胞計數(shù)差值

2.1.4 對TLD6B生長狀況的影響 圖4是TLD6B經(jīng)不同抗生素不同濃度梯度處理后培養(yǎng)至第7 d 時與未加抗生素的藻液培養(yǎng)至第7 d 時的藻細胞數(shù)差值。由圖可知，TLD6B 對低濃度的氨芐西林與頭孢霉素的敏感性不大，氨芐西林濃度為200 μg/mL、頭孢霉素濃度為50 μg/mL時，對TLD6B的生長基本沒有表現(xiàn)出抑制作用；當氨芐西林濃度為400 μg/mL、頭孢霉素濃度為100 μg/mL 以上時，對TLD6B 的生長才表現(xiàn)出較為明顯的抑制作用，且隨著抗生素濃度的增加，其抑制作用越來越強。TLD6B對鏈霉素、卡那霉素、氯霉素都較為敏感，這3 種抗生素在所設(shè)最低濃度25 μg/mL 時對TLD6B 的生長就有非常明顯的抑制作用，且隨著抗生素濃度的增加，抑制作用越來越明顯，其抑制作用強度依次為鏈霉素＞卡那霉素＞氯霉素。因此，可在TLD6B 的培養(yǎng)液中加入低濃度的氨芐西林或頭孢霉素作為抑菌劑，這樣不僅可以避免污染，還對TLD6B 細胞的生長具有促進作用，適于實驗室的規(guī)?；囵B(yǎng)和無菌藻液的制備；而鏈霉素、卡那霉素則可作為TLD6B 藻細胞基因工程遺傳轉(zhuǎn)化中的選擇標記。

2.2 不同抗生素作用下沙漠小球藻培養(yǎng)液顏色的變化

依據(jù)前述方法，用抗生素處理各藻種，定期觀察六孔板中各藻液顏色的變化，培養(yǎng)7 d 時的各藻液顏色結(jié)果見表2。

2.3 沙漠小球藻對不同抗生素的敏感性測定結(jié)果

圖4 5種抗生素不同濃度梯度與未加抗生素作用下培養(yǎng)至第7 d時TLD6B的細胞計數(shù)差值

綜合各抗生素對4 株沙漠小球藻生長狀況的影響及其培養(yǎng)到7 d時培養(yǎng)液顏色的變化，將4株沙漠小球藻對各抗生素的敏感性總結(jié)于表3，當各抗生素的濃度達到表中數(shù)值時，都對各藻株的生長具有明顯的抑制作用，表現(xiàn)為非常敏感。

3 討論

從國外研究進展來看，迄今選擇標記小球藻基因工程中常用的是G418（氨基糖苷類抗生素）[12-13]和潮霉素[14-16]，但不同種類的小球藻對抗生素的敏感性不一，以上研究結(jié)果也有差別。從國內(nèi)進展看，王逸云等[17]對從海水里分離純化得到的一株小球藻做了10 種常用抗生素的敏感性實驗，結(jié)果表明這株小球藻對新霉素、慶大霉素、卡那霉素、頭孢霉素、鏈霉素和氨芐西林不敏感，對G418 和潮霉素敏感，對博來霉素和氯霉素非常敏感。陳穎等[18]對橢圓小球藻的抗生素敏感性做了研究，結(jié)果表明橢圓小球藻對鏈霉素、氯霉素和卡那霉素不敏感，對潮霉素敏感，對G418非常敏感。淦志兵等[19]進行了原殼小球藻的抗生素敏感性實驗，結(jié)果表明原殼小球藻對氯霉素不敏感，對卡那霉素、鏈霉素、壯觀霉素敏感，對潮霉素極其敏感，對G418 非常敏感。屈建航[20]對普通小球藻抗生素敏感性的實驗研究表明，該小球藻對四環(huán)素、氯霉素、卡那霉素和氨芐西林的敏感性不明顯。

目前有關(guān)沙漠環(huán)境中的小球藻基因工程選擇標記篩選研究還未見報道。在本實驗中，我們探討了4株沙漠小球藻的抗生素敏感性，發(fā)現(xiàn)4株沙漠小球藻對氨芐西林和頭孢霉素都不是很敏感，而對卡那霉素、氯霉素和鏈霉素都很敏感，這與淦志兵[19]的結(jié)果相符，但卻與王逸云[17]、陳穎[18]、屈建航[20]的研究結(jié)果不盡一致。造成這種差異的可能原因有：①藻種不同，對抗生素的敏感性也不同；②生長環(huán)境和所用培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分不同，對抗生素的敏感性程度可能也不同。提示我們，在做某一類藻種的基因工程遺傳轉(zhuǎn)化選擇標記研究時，均須進行大量抗生素濃度梯度敏感性實驗，以確定最佳遺傳轉(zhuǎn)化選擇標記。

綜上，我們就4株沙漠小球藻對5種常用抗生素的敏感性做了初步研究，最終確定卡那霉素和鏈霉素可作為這4 株沙漠小球藻基因工程遺傳轉(zhuǎn)化的選擇標記，為今后沙漠小球藻基因工程遺傳轉(zhuǎn)化選擇標記提供了資料。

表2 不同抗生素作用下沙漠小球藻培養(yǎng)液顏色的變化

表3 4株沙漠小球藻對各抗生素的敏感性測定結(jié)果（μg/mL）

[1]Apt K E,Behrens P W.Commercial developments in microalgal biotechnology[J].Phyeology,1999,35:215-226.

[2]蓼曉玲,吳慶余.微藻生物質(zhì)可再生能源的開發(fā)利用[J].可再生能源,2003,3(109):13-16.

[3]趙建成,張丙昌,張元明.新疆古爾班通古特沙漠生物結(jié)皮綠藻研究[J].干旱區(qū)研究,2006,23(2):189-194.

[4]孟春曉,高政權(quán).微藻生物反應器的研究進展[J].水利漁業(yè),2007,27(5):6-8.

[5]丁希民.小球藻的作用及優(yōu)劣鑒別[J].科學養(yǎng)魚,2012,(5):24-25.

[6]Potvin G,Zhang Z.Strategies for high-level recombinant protein expression in transgenic microalgae:a review[J].Biotechnol Adv,2010,28(6):910-918.

[7]李芳芳,隋正紅,高劍峰,等.6 株沙漠綠藻的分離鑒定及其18SrDNA 保守區(qū)片段差異分析[J].石河子大學學報（自然科學版）,2012,30(3):265-270.

[8]李芳芳,隋正紅,高劍峰,等.兩種沙漠微藻的形態(tài)學和分子生物學鑒定[J].干旱區(qū)資源與環(huán)境,2013,27(3):167-172.

[9]薩姆布魯克,拉塞爾.分子克隆實驗指南[M]∥黃培堂,等譯.北京:科學出版社,2002:1599-1599.

[10]土壤微生物研究會[日].土壤微生物實驗法[M]∥葉維青,張維謙,周鵬里,等譯.北京:科學出版社,1983:653-653.

[11]秦翠麗,李松彪.微生物學實驗技術(shù)[M].北京:兵器工業(yè)出版社,2008:55-56.

[12]Bai L L,Yin W B,Chen Y H,et al.A new strategy to produce a defensin:stable production of mutated NP-1 in nitrate reductase-deficient Chlorella ellipsoidea[J].PLoS One,2013,8(1):e54966-e54966.

[13]Hawkins R L,Nakamura M.Expression of human growth hormone by the eukaryotic alga,Chlorella[J].Curr Microbiol,1999,38(6):335-341.

[14]Cha T S,Yee W,Aziz A.Assessment of factors affecting Agrobacterium-mediated genetic transformation of the unicellular green alga,Chlorella vulgaris[J].World J Microbiol Biotechnol,2012,28(4):1771-1779.

[15]Chow K C,Tung W L.Electrotransformation of Chlorella vulgaris[J].Plant Cell Rep,1999,18(9):778-780.

[16]Huang C C,Chen M W,Hsieh J L,et al.Expression of mercuric reductase from Bacillus megaterium MB1 in eukaryotic microalga Chlorella sp.DT:an approach for mercury phytoremediation[J].Appl Microbiol Biotechnol,2006,72(1):197-205.

[17]王逸云,王長海.小球藻基因工程選擇標記研究[J].大連理工大學學報,2007,47(4):509-514.

[18]陳穎,李文彬,張利明,等.小球藻對5種常用基因工程抗生素的敏感性研究[J].海洋與湖沼,1999,30(5):500-505.

[19]淦志兵,李美芽,施春雷,等.原殼小球藻對6種常用抗生素的敏感性評價[J].中國食品學報,2012,12(7):171-177.

[20]屈建航.5 種綠藻對幾種常用抗生素的敏感性[J].大連輕工業(yè)學院學報,2004,23(2):111-113.