莊 靜，汪叢叢，呂慶亮，劉澤旺，秦寶寧，曹曉靖，孫長(zhǎng)崗

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，南京 210023;2.濰坊市中醫(yī)院，山東濰坊 261041;3.濰坊醫(yī)學(xué)院山東 濰坊 261000;4.山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250355)

天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)是從栝樓等葫蘆科植物根塊中提取的一種高分子蛋白質(zhì)，廣泛應(yīng)用于臨床治療［1］。天花粉蛋白可有效地通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，是目前惡性腫瘤治療的一種全新治療手段。因?qū)φ＝M織毒副作用小、抗癌譜廣、價(jià)格低廉，使其較傳統(tǒng)化療藥物有顯著優(yōu)勢(shì)，受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注［2］。本文旨在研究天花粉蛋白(TCS)對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡信號(hào)分子caspase-3表達(dá)的影響及其作用機(jī)制與JNK信號(hào)傳導(dǎo)通路激活的相關(guān)性，從細(xì)胞和分子水平上揭示TCS誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的機(jī)理，為天花粉蛋白在今后腫瘤防治中的應(yīng)用提供重要的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺腺癌A549細(xì)胞株購(gòu)自上海普林斯頓生物科技發(fā)展有限公司試劑部，天花粉蛋白(1.2 mg/ml)購(gòu)自上海金山制藥有限公司，絲裂霉素、鏈霉素(10 mg/支)由浙江海正藥業(yè)公司生產(chǎn)，DMEM、新生胎牛血清、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自杭州四季青公司，RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Promega公司)，碘化丙啶(PI)(美國(guó) Sigma公司)，MTT(美國(guó) Amresco公司)。SP600125(美國(guó) Alexis公司)，鼠抗人β-actin抗體(美國(guó) Sigma公司)，鼠抗人 JNK、鼠抗人caspase-3單抗及HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗(美國(guó)SANTA CRUZ公司)，PVDF膜(美國(guó)BD公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺癌細(xì)胞株A549采用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液(青霉素100 U/ml、鏈霉素100 U/ml，pH7.2)，常規(guī)37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法測(cè)定TCS對(duì)人肺癌A549細(xì)胞增殖活性的影響 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1.0×105/ml，每孔加入新鮮培養(yǎng)液100 μl，37℃孵育24 h。實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的 TCS 注射液(25、50、100 μg/ml)，同時(shí)設(shè)置對(duì)照孔(1‰DMSO)，每孔再設(shè)3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。培養(yǎng)結(jié)束后，吸除原培養(yǎng)液，每孔加入20 μL的 MTT溶液(5 μg/ml)作用4 h。再加入100 μL二甲基亞楓(DMSO)，搖床緩慢震蕩15 min。設(shè)置A1為調(diào)零孔，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔在OD(570 nm)處的光密度值(即A值)。計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(1－實(shí)驗(yàn)孔A值/對(duì)照組A值)×100%。

1.2.3 天花粉蛋白對(duì)肺癌A549細(xì)胞JNK信號(hào)通路的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，各組分別加入不同濃度的 TCS 注射液(25、50、100 μg/ml)，常規(guī)培養(yǎng)48 h，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×105/ml，每孔加入200 μl細(xì)胞懸液，且設(shè)3個(gè)復(fù)孔。加入細(xì)胞裂解緩沖液預(yù)處理，提取上清細(xì)胞總蛋白，分光光度法定量。再次離心取50 μg蛋白上樣到12%SDS-聚丙烯酰胺預(yù)制膠分離，印跡轉(zhuǎn)染醋酸纖維膜。用含5%脫脂干燥奶粉37℃封閉1 h。加入抗JNK(1∶1000)、p-JNK(1∶1000)抗體于4℃過(guò)夜。分別加入HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗37℃孵育1 h。加入ECL后沖洗、曝光，分析所顯影條帶的性質(zhì)。

1.2.4 天花粉蛋白對(duì)人肺癌 A549細(xì)胞Caspase-3 mRNA的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，隨機(jī)分為對(duì)照組、SP組、25 μmol/mlTCS組以及TCS+SP組，處理細(xì)胞24 h，以5×105個(gè)/ml細(xì)胞濃度的肺癌A549細(xì)胞加入1 ml Trizol溶液，室溫放置5 min，使細(xì)胞充分裂解。常溫下離心，棄沉淀取上清液。按200 μl氯仿/ml Trizol的比例加入氯仿，震蕩15 min，按照Trizol試劑盒說(shuō)明提取總RNA。引物設(shè)計(jì)參照Premier 6.0設(shè)計(jì)(如表1)。按照RTPCR試劑盒操作說(shuō)明，其產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離檢測(cè)。凝膠成像系統(tǒng)掃描分析電泳條帶，計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，完全隨機(jī)分組實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)的多組比較采用方差分析，成組分析采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 MTT法測(cè)定TCS對(duì)人肺癌A549細(xì)胞增殖的影響

為觀察TCS對(duì)肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)的狀況，采用 MTT 法分析 TCS 在 0、25、50、100 μg/ml濃度處理后A549細(xì)胞增殖情況。MTT法顯示，TCS對(duì)人肺癌A549細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作用明顯，且呈時(shí)間和劑量依賴(lài)性，各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

表2 TCS對(duì)A549細(xì)胞增殖抑制作用

2.2 TCS對(duì)肺癌 A549細(xì)胞JNK、p-JNK蛋白的表達(dá)

為觀察TCS對(duì)肺癌A549細(xì)胞內(nèi)JNK信號(hào)通路的影響，我們采用Western blot法分析在不同濃度TCS處理后細(xì)胞內(nèi)JNK、p-JNK蛋白的表達(dá)情況。免疫印跡結(jié)果顯示，隨著天花粉蛋白濃度的升高，磷酸化JNK表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P＜0.05);而JNK表達(dá)水平與天花粉蛋白藥物濃度無(wú)明顯變化(P ＞0.05)。

2.3 JNK通路介導(dǎo)的天花粉蛋白誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞Caspase-3 mRNA的表達(dá)

為觀察JNK通路在 TCS對(duì)肺癌A549細(xì)胞caspase-3表達(dá)的作用，我們采用RT-PCR法分析由對(duì)照組、SP 組、25 μmol/mlTCS 組、50 μmol/mlTCS組以及TCS+SP組處理后，細(xì)胞內(nèi)Caspase-3 mRNA的表達(dá)情況。RT-PCR顯示，細(xì)胞內(nèi) Caspase-3 mRNA的表達(dá)量隨TCS濃度增加呈上升趨勢(shì)，2組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。預(yù)先加入JNK特異性抑制劑，Caspase-3表達(dá)量相較于對(duì)照組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖1

圖2 TCS干預(yù)肺癌A549細(xì)胞Caspase-3mRNA表達(dá)的影響

3 討論

天花粉是我國(guó)傳統(tǒng)中草藥，為葫蘆科植物栝樓的塊根，因其粉潔白如雪，故名天花粉［3］。天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)是天花粉的有效成分。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，TCS具有多種藥理學(xué)活性，主要包括免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤和抗人免疫缺陷病毒、引產(chǎn)等［4］。其生物學(xué)活性與其誘導(dǎo)凋亡、抑制增殖能力有關(guān)，且天花粉蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞具有比較明顯的細(xì)胞選擇毒性。以往對(duì)天花粉蛋白的抗腫瘤研究主要集中在結(jié)構(gòu)、酶學(xué)功能、藥理作用等方面，對(duì)其引起腫瘤細(xì)胞凋亡和信號(hào)傳導(dǎo)的分子機(jī)制研究較少。因此，為更好地應(yīng)用于臨床，更多地為人們所認(rèn)同，對(duì)天花粉蛋白抗腫瘤細(xì)胞作用的具體可能機(jī)制進(jìn)行深入研究是非常有必要的。

Caspase-3是Caspase家族的最重要成員，是調(diào)控細(xì)胞凋亡的最終執(zhí)行分子，在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中發(fā)揮著不可替代的作用［5，6］。細(xì)胞凋亡過(guò)程中Caspase-3作為下游信號(hào)分子主要有以下兩方面作用:一方面，其作為啟動(dòng)物，接受凋亡信號(hào)而發(fā)生細(xì)胞內(nèi)的級(jí)聯(lián)反應(yīng);另一方面，可作為效應(yīng)物水解各種細(xì)胞成分從而形成凋亡小體［7］。Caspase-3以無(wú)活性的酶原形式存在于細(xì)胞的內(nèi)部，只有經(jīng)過(guò)水解加工成活性片段才可以發(fā)揮生物學(xué)活性。JNK信號(hào)通路是促分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路的一個(gè)重要分支［8］，也是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中最重要的傳導(dǎo)通路之一，在調(diào)控細(xì)胞增殖分化、凋亡、應(yīng)激及參與細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)等多種生理和病理過(guò)程中起至關(guān)重要的作用。

據(jù)文獻(xiàn)記載［9，10］，天花粉蛋白可以通過(guò)激活JNK信號(hào)通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)caspase-3蛋白的活化，是其抑制腫瘤生長(zhǎng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TCS可明顯抑制A549細(xì)胞增殖活性，且與濃度和作用時(shí)間呈正相關(guān)。TCS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中伴有JNK信號(hào)通路的激活。磷酸化JNK蛋白的表達(dá)水平相應(yīng)增加，而JNK蛋白變化不顯著。此外，細(xì)胞內(nèi)Caspase-3 mRNA的表達(dá)量隨TCS藥物濃素增加呈上升趨勢(shì)。選取JNK特異性抑制劑SP600125，SP組Caspase-3 mRNA表達(dá)量相較于對(duì)照組減少。結(jié)果提示，TCS誘導(dǎo)caspase-3 mRNA活化的同時(shí)可能與JNK信號(hào)通路的激活有關(guān)。caspase-3酶原的激活對(duì)于天花粉蛋白誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡也是必不可缺的，JNK特異性抑制劑SP600125可有效地抑制細(xì)胞凋亡，在天花粉蛋白誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡中，Caspase-3發(fā)揮了重要作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)天花粉蛋白可以有效地抑制肺癌細(xì)胞的增殖，JNK信號(hào)通路的激活以及胞內(nèi)caspase-3蛋白的表達(dá)是其抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。今后我們的實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)一步涉及其他參與調(diào)控分子的研究，以便從細(xì)胞和分子水平上揭示TCS誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的機(jī)理，為天花粉蛋白在腫瘤防治中的應(yīng)用，提供重要的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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