劉彥魁，游慶軍，金琳芳，馮靜潔，齊曉薇

(無錫市第四人民醫(yī)院，江蘇無錫214062)

淋巴轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的主要方式。瘤細(xì)胞浸入淋巴管后，隨淋巴流首先到達(dá)局部引流淋巴結(jié)，之后聚集于邊緣竇，繼續(xù)增殖累及整個(gè)淋巴結(jié)。結(jié)直腸癌伴淋巴轉(zhuǎn)移者預(yù)后明顯不良，且對(duì)放化療敏感性低［1～3］。CXCL13是趨化因子 CXC 家族的一員，主要分布在人體肝臟、淋巴結(jié)和血清中，其編碼基因定位于 4q21［4，5］。CXCL13 能夠吸附 B 細(xì)胞，并參與免疫系統(tǒng)信號(hào)的傳遞。CXCL13與其受體CXCR5共同作用發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，后者主要分布在成熟B細(xì)胞上，參與免疫功能微環(huán)境的構(gòu)建，具有協(xié)調(diào)體液免疫的功能。最近研究表明，CXCL13及其受體CXCR5的表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有緊密的關(guān)系［6，7］。KRAS基因是結(jié)直腸癌的重要相關(guān)基因，已有分子靶向藥物絡(luò)氨酸激酶抑制劑用于臨床。結(jié)直腸癌組織中CXCL13表達(dá)是否與KRAS基因有關(guān)尚不清楚。2013年1～11月，我們觀察了CXCL13及其受體CXCR5對(duì)結(jié)直腸癌淋巴轉(zhuǎn)移的影響，并探討其與KRAS基因突變的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 97例結(jié)直腸癌原發(fā)灶標(biāo)本(觀察A組)和51例轉(zhuǎn)移灶標(biāo)本(觀察B組)為2007～2009年間無錫市第四人民醫(yī)院手術(shù)切除標(biāo)本，經(jīng)病理檢查確診;52例正常結(jié)直腸標(biāo)本(對(duì)照A組)和43例正常淋巴結(jié)標(biāo)本(對(duì)照B組)為2011～2012年該院手術(shù)切除標(biāo)本，經(jīng)病理診斷為癌癥陰性者。觀察組結(jié)直腸癌患者中男63例，女85例;對(duì)照組男45例，女50例。兩組入選標(biāo)本所涉及患者年齡36～77歲，中位年齡49歲。本研究涉及患者標(biāo)本采集前均簽署知情同意書，手術(shù)前均未接受放化療及其他特殊藥物治療。觀察組結(jié)腸癌84例，直腸癌64例;管狀腺癌58例，乳頭狀腺癌52例，黏液癌31例，未分化癌7例。隨訪?個(gè)月，失訪11例，死亡41例，意外死亡4例。

1.2 CXCL13和CXCR5表達(dá)檢測(cè)及結(jié)果判定方法采用免疫組化法。CXCR5和CXCL13鼠抗人抗體購自美國R＆D Systems公司，DAB顯色劑購自基因科技上海有限公司。標(biāo)本采集后立即浸入10%中性甲醛液中固定12 h，經(jīng)病理醫(yī)生取材后、脫水、透明、包埋，4 μm切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇除去二甲苯，高壓鍋修復(fù)，3%的正常羊血清封閉特異性位點(diǎn)20 min，接著用一抗孵育1 h，二抗孵育30 min，最后用DAB顯色。免疫組化結(jié)果由兩名副主任以上職稱醫(yī)師判讀得出。細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕褐色為CXCR5或CXCL13陽性。按著色強(qiáng)度評(píng)分:無著色得0分，弱陽性得1分，中等強(qiáng)度陽性得2分，強(qiáng)陽性得3分。按陽性細(xì)胞比例評(píng)分:無細(xì)胞著色得0分，陽性細(xì)胞比例1%～9%得0.1分，陽性細(xì)胞比例10%～49%的0.5分，陽性細(xì)胞比例大于50%得1分。最終結(jié)果H評(píng)分為著色強(qiáng)度評(píng)分和陽性細(xì)胞比例得分的乘積［6］。

1.3 KRAS基因突變情況檢測(cè)方法 KRAS基因突變檢測(cè)試劑盒購自廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司。首先用FFPE DNA提取試劑盒提取石蠟包埋的原發(fā)灶或者轉(zhuǎn)移灶標(biāo)本的DNA，然后采用Real Time PCR法檢測(cè)人類KRAS基因的突變，包括12和13密碼子上7種熱點(diǎn)體細(xì)胞的突變，分別為:Gly12Asp、Gly12Ala、Gly12Val、Gly12Ser、Gly12Arg、Gly12Cys、Gly13Asp。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料的集中趨勢(shì)與離散趨勢(shì)以±s表示。各臨床病理參數(shù)與CXCL13和CXCR5表達(dá)的相關(guān)性分析采用四格表χ2或R×C列表χ2分析;組間生存分析數(shù)據(jù)的比較應(yīng)用Kaplan-Meier's分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CXCL13及CXCR5表達(dá) CXCL13主要表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞，觀察A組陽性表達(dá)率為36.08%，觀察B組47.06%，對(duì)照A組0，對(duì)照 B組11.63%。CXCL13陽性表達(dá)率觀察B組＞觀察A組＞對(duì)照B組＞對(duì)照A組，P均＜0.05。CXCR5主要表達(dá)于上皮細(xì)胞，觀察 A組陽性表達(dá)率 41.24%，觀察 B組49.01%，對(duì)照A組0，對(duì)照B組9.30%。CXCR5陽性表達(dá)率觀察B組＞觀察A組＞對(duì)照B組＞對(duì)照A組，P均＜0.05。觀察組CXCL13與CXCR5表達(dá)水平有相關(guān)性(P＜0.05)。

2.2 CXCL13及CXCR5蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 觀察組CXCL13及CXCR5蛋白表達(dá)與TNM分期呈正相關(guān)(P＜0.05)，與分化程度呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，與患者的性別、年齡、腫瘤大小及腫瘤組織學(xué)分類等無明顯相關(guān)(P均＞0.05)。詳見表1。

表1 觀察組CXCL13及CXCR5蛋白陽性表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 CXCL13及CXCR5蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌預(yù)后的關(guān)系 觀察B組CXCL13表達(dá)陽性者5年無進(jìn)展中位生存時(shí)間(PFS)為(9.0±2.3)個(gè)月，陰性者為(12.0±7.3)個(gè)月，P ＜0.05;CXCR5表達(dá)陽性者5 年P(guān)FS為(11.4 ±5.4)個(gè)月，陰性者為(25.5 ±9.3)個(gè)月，P＜0.05。觀察A組CXCL13表達(dá)陽性者5年P(guān)FS為(25.0 ±11.3)個(gè)月，陰性者(37.0 ±16.5)個(gè)月，P＜0.05;CXCR5表達(dá)陽性者5年P(guān)FS為(21.7±4.8)個(gè)月，陰性者為(55.0 ±17.5)個(gè)月，P ＜0.05。

2.4 CXCL13及CXCR5蛋白表達(dá)與KRAS基因突變的關(guān)系 觀察A組KRAS基因突變型36例(其中CXCL13表達(dá)陽性12例、CXCR5表達(dá)陽性17例)，野生型61例(其中CXCL13表達(dá)陽性23例、CXCR5表達(dá)陽性23例)，CXCL13及CXCR5蛋白表達(dá)與KRAS基因是否發(fā)生突變均有相關(guān)性(P均＜0.05)。觀察B組KRAS基因突變型20例(其中CXCL13表達(dá)陽性16例、CXCR5表達(dá)陽性14例)，野生型31例(其中CXCL13表達(dá)陽性8例、CXCR5表達(dá)陽性11例)，CXCL13及CXCR5蛋白表達(dá)與KRAS基因是否發(fā)生突變均有相關(guān)性(P均＜0.05)。

3 討論

結(jié)直腸癌是我國常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率僅次于胃癌和食管癌，居腫瘤發(fā)病率的第5位，且近年有逐漸增加的趨勢(shì)［8，9］。結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移常作為評(píng)價(jià)預(yù)后的重要指標(biāo)，轉(zhuǎn)移的程度對(duì)治療策略的選擇也有重要的意義。結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移以淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為主，結(jié)腸癌在結(jié)腸上、旁、中間和終末四組淋巴結(jié)均有轉(zhuǎn)移;直腸癌首先轉(zhuǎn)移至直腸旁淋巴結(jié)，然后再擴(kuò)散，浸及直腸及肛周組織［3，10］。近年發(fā)現(xiàn)一系列與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移有重要關(guān)系的小分子調(diào)節(jié)蛋白，趨化因子就是其中重要的一類。趨化因子通過與其受體相互作用發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。

趨化因子主要有C、CC、CXC、CX3C四個(gè)家族，其主要與機(jī)體的免疫系統(tǒng)相關(guān)。最早發(fā)現(xiàn)其與HIV病毒感染的機(jī)制有一定的關(guān)系［11，12］。近年研究發(fā)現(xiàn)，其與多種腫瘤的進(jìn)展有一定的關(guān)系，尤其是CXCL13及其受體蛋白CXCR5的表達(dá)。CXCL13是CXC家族的一種，研究者最先在肝臟和淋巴結(jié)中檢測(cè)到其表達(dá)。Burkle等［13］研究發(fā)現(xiàn)CXCR5在慢性淋巴細(xì)胞白血病病情的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。CXCLl3和CXCR5的表達(dá)與HIV感染過程中B細(xì)胞機(jī)能障礙的形成有關(guān)。張巖等［14］檢測(cè)到其在胸腺瘤合并重癥肌無力的發(fā)病中發(fā)揮重要作用，CXCL13及其受體CXCR5的表達(dá)更易引起上述疾病的發(fā)生。易誠青等［15］發(fā)現(xiàn)CXCL13和CXCR5與成骨活躍程度相關(guān)，并表現(xiàn)為明顯的時(shí)間與位點(diǎn)特征。鄒春華等［16］研究發(fā)現(xiàn)CXCR5的表達(dá)與肺癌組織學(xué)類型密切相關(guān)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)其與結(jié)直腸癌組織學(xué)類型和復(fù)發(fā)有一定關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示，CXCL13在結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)高于原發(fā)灶，在正常的結(jié)直腸組織中未檢測(cè)到其表達(dá)。CXCL13在轉(zhuǎn)移灶淋巴結(jié)中的表達(dá)明顯高于正常淋巴結(jié)。CXCR5的表達(dá)與CXCL13具有相似的特征。由此可以看出，CXCL13及其受體蛋白CXCR5可以作為評(píng)估結(jié)直腸癌發(fā)病及轉(zhuǎn)移的新的指標(biāo)。但是關(guān)于CXCL13及CXCR5在結(jié)直腸癌發(fā)病中的具體作用機(jī)制，仍需要進(jìn)一步研究。通過觀察CXCL13及CXCR5的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)CXCL13及CXCR5的表達(dá)與結(jié)直腸癌的TNM分期和腫瘤的分化程度具有相關(guān)性。腫瘤的TNM分期越高，越容易檢測(cè)到CXCR5的表達(dá);腫瘤的分化程度越低，越易檢測(cè)到CXCL13及CXCR5的表達(dá)。后者與曹寶森等［4］研究發(fā)現(xiàn)的CXCL13及CXCR5在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)特點(diǎn)具有一定的相似性。

結(jié)合隨訪資料分析發(fā)現(xiàn)，無論是否有淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，在有CXCL13及其受體蛋白CXCR5表達(dá)組中，其無進(jìn)展生存期均短于CXCL13及CXCR5無表達(dá)者?？梢钥闯觯珻XCL13及其受體蛋白CXCR5的表達(dá)，是結(jié)直腸癌不良預(yù)后的一個(gè)標(biāo)志。這與Razis等［17］研究發(fā)現(xiàn) CXCL13及 CXCR5的表達(dá)對(duì) Her2陰性乳腺癌患者預(yù)后的影響是一致的，然而對(duì)于Her2陽性的乳腺癌患者，CXCL13及CXCR5的表達(dá)卻是一個(gè)有利的預(yù)后因子。CXCL13及CXCR5如何與Her2基因發(fā)生相互作用以及其具體作用的機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。

KRAS基因是RAS基因家族的一種，定位于第12號(hào)染色上。在RAS基因家族中，KRAS對(duì)人類癌癥影響最大，它能控制調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)的信號(hào)通路;其發(fā)生異常時(shí)，則導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)，并阻止細(xì)胞自我毀滅。它參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞，若KRAS基因發(fā)生突變，該基因永久活化，不能產(chǎn)生正常的RAS蛋白，使細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)紊亂，細(xì)胞增殖失控而癌變［18～20］。當(dāng)前研究其與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有較為明顯的關(guān)系，尤其是對(duì)結(jié)直腸癌的預(yù)后有較為明顯的關(guān)系。在KRAS未發(fā)生突變的情況下，使用分子靶向藥物帕尼單抗治療結(jié)直腸癌患者取得了較好的治療效果［21，22］。本研究發(fā)現(xiàn)，CXCL13 及其受體蛋白CXCR5的表達(dá)與KRAS基因的突變具有一定的相關(guān)性，我們推測(cè)CXCL13及CXCR5與KRAS基因的信號(hào)傳遞有一點(diǎn)關(guān)聯(lián)，其具體影響機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果表明，趨化因子CXCL13及CXCR5蛋白在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)高于其原發(fā)灶，提示其與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移有一定相關(guān)，其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步探索。CXCL13及CXCR5蛋白表達(dá)陽性的結(jié)直腸癌患者其無進(jìn)展生存期明顯低于CXCL13及 CXCR5陰性表達(dá)患者，提示 CXCL13及CXCR5是結(jié)直腸癌患者的不良預(yù)后因子，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。CXCL13及CXCR5的表達(dá)與KRAS基因的突變有一定的相關(guān)性，CXCL13及CXCR5表達(dá)的患者中KRAS基因突變發(fā)生率較高，提示CXCL13及CXCR5可能參與KRAS基因信號(hào)的傳遞，其具體影響機(jī)制尚需深入探討。

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