周章明，楚勝華

(1成都大學(xué)附屬都江堰醫(yī)療中心，四川都江堰611830;2上海交通大學(xué)附屬第三醫(yī)院)

放化療是目前常見的腫瘤術(shù)后治療手段。逃避凋亡是腫瘤發(fā)生、發(fā)展和產(chǎn)生藥物抵抗的重要機(jī)制［1］。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡并增強(qiáng)其對化療藥物的敏感性是目前腫瘤治療的研究熱點(diǎn)。果蠅zeste基因增強(qiáng)子人類同源物2(EZH2)是多疏基因(PcG)蛋白家族的重要成員，與腫瘤細(xì)胞凋亡并在促進(jìn)癌細(xì)胞生長、侵襲、轉(zhuǎn)移中起重要作用［2］?？就】梢酝ㄟ^血腦屏障，該藥物及其代謝物可通過烷化作用與核酸交鏈，并有可能因改變蛋白質(zhì)而產(chǎn)生抗腫瘤作用，為膠質(zhì)瘤化療的重要藥物之一［3-5］。2012年5月～2013年6月，我們用RNA干擾技術(shù)抑制人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中EZH2基因的表達(dá)，并檢測干擾后U251細(xì)胞對卡莫司汀的敏感性?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞購于中國科學(xué)院細(xì)胞所。細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%新生小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，內(nèi)加青霉素1×105U/mL，鏈霉素 100 mg/mL，置于 5%CO2、飽和濕度、37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。分為空白對照組、脂質(zhì)體組、陰性對照組和pRNAT-EZH2組。

1.2 小干擾RNA(siRNA)真核表達(dá)載體的構(gòu)建具有互補(bǔ)序列的能夠編碼短發(fā)卡RNA(shRNA)的雙鏈寡核苷酸模板DNA由上海康成公司合成。其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物所形成的siRNA的作用靶點(diǎn)為人EZH2 mRNA。干擾序列為:AAGACTCTGAATGCAGTTGCT;在兩端分別懸垂Sal I、Xba I的酶切位點(diǎn)，3'端酶切位點(diǎn)之前加入終止信號TTTT;陰性對照是雙鏈寡核苷酸轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物所形成的siRNA，此序列不與任何人類基因序列同源。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 用Lipofectin-2000TM(美國Invitrogene公司)介導(dǎo)進(jìn)行轉(zhuǎn)染?？瞻讓φ战M不轉(zhuǎn)染。脂質(zhì)體組轉(zhuǎn)染液中僅含脂質(zhì)體無siRNA。陰性對照組轉(zhuǎn)染液加入空質(zhì)粒pRNAT-Negative。pRNAT-EZH2組轉(zhuǎn)染液加入重組pRNAT-EZH2質(zhì)粒。

1.4 U251細(xì)胞中EZH2 mRNA檢測方法 收集轉(zhuǎn)染24、48、72 h各組細(xì)胞，用 Trizol(美國 Invitrogene公司)提取細(xì)胞總RNA，采用RT-PCR法檢測EZH2 mRNA，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。EZH2引物序列:上游 5'-GCCAGACTGGGAAGAAATCTG-3'，下游3'-TGTGCTGGAAAATCCAAGTCA-5'，產(chǎn)物大小為86 bp。β-actin引物序列:上游 5'-ATCTGGCACCAAACACCTTCTACAATGAGCTGCG-3'，下游5'-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3'，產(chǎn)物為167 bp。以EZH2與β-actin條帶的積分吸光度比值表示EZH2 mRNA的相對表達(dá)量。

1.5 卡莫司汀處理后各組細(xì)胞凋亡檢測方法 將轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞以2×105個/mL的密度接種在6孔培養(yǎng)板中，分別加入含卡莫司汀 10、25、50 μmol/L的完全培養(yǎng)基，每組設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)24、48 h后小心吸去培養(yǎng)液，加入0.5 mL細(xì)胞固定液，室溫下固定10 min。吸去固定液，用PBS洗兩遍，洗滌時用搖床晃動，每次3 min，吸盡液體。加入0.5 mL Hoechst 33258染色液，染色5 min。PBS洗兩遍，每次3 min，吸盡液體。滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片，盡量避免汽泡，使細(xì)胞接觸封片液。用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況，激發(fā)波長352 nm，發(fā)射波長461 nm。

1.6 卡莫司汀處理后各組細(xì)胞增殖抑制情況檢測方法 采用MTT法。取pRNAT-EZH2組、陰性對照組、空白對照組的對數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔加入細(xì)胞1×104個，24 h后加入含卡莫司汀10、25、50 μmol/L 的完全培養(yǎng)基，每組設(shè)3 個復(fù)孔，繼續(xù)作用24 h，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄去培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μL，酶標(biāo)儀測定570 nm處吸光度(A)值。取3孔平均A值。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

1.7 Caspase-3檢測方法 取 pRNAT-EZH2組、陰性對照組、空白對照組的對數(shù)生長期細(xì)胞，24 h后加入含卡莫司汀 0、10、25、50μmol/L 的完全培養(yǎng)基，加入細(xì)胞裂解液裂解，用分光光度計(jì)檢測Caspase-3水平。操作按試劑盒說明進(jìn)行。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，組間比采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EZH2 mRNA 轉(zhuǎn)染72 h，空白對照組、脂質(zhì)體組、陰性對照組、pRNAT-EZH2組 U251細(xì)胞EZH2 mRNA相對表達(dá)量分別為 0.597±0.046、0.603 ±0.031、0.428 ± 0.047、0.151 ± 0.008。pRNAT-EZH2組與空白對照組相比，P＜0.05，空白對照組與陰性對照組及脂質(zhì)體組相比，P均＞0.05。pRNAT-EZH2組轉(zhuǎn)染24、48、72h時 EZH2 mRNA 表達(dá)抑制率分別為58.19%、73.37%和74.58%。

2.2 細(xì)胞凋亡情況 空白對照組及陰性對照組細(xì)胞經(jīng)Hoechst 33258染色后，激光共聚焦顯微鏡下觀察見細(xì)胞均勻藍(lán)染，脂質(zhì)體組和pRNAT-EZH2組細(xì)胞則檢測出明顯的細(xì)胞凋亡，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見濃染致密的顆粒狀藍(lán)色熒光及明顯的熒光碎片，pRNAT-EZH2組凋亡細(xì)胞最多。

圖1 各組細(xì)胞凋亡情況激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果

2.3 細(xì)胞增殖抑制率和Caspase-3相對表達(dá)量pRNAT-EZH2轉(zhuǎn)染后，U251細(xì)胞增殖抑制率和Caspase-3相對表達(dá)量明顯高于空白對照組和陰性對照組(P均＜0.01)，而空白對照組和陰性對照組的生長抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳見表1。

表1 不同濃度卡莫司汀處理后各組U251細(xì)胞增殖抑制率和Caspase-3相對表達(dá)量(±s)

表1 不同濃度卡莫司汀處理后各組U251細(xì)胞增殖抑制率和Caspase-3相對表達(dá)量(±s)

注:與空白對照組和陰性對照組相比，*P＜0.05

組別 n 細(xì)胞增殖抑制率(%)Caspase-3相對表達(dá)量空白對照組3 0 μmol/L 1.00 ±0.05 10 μmol/L 2.21 ±0.32 1.59 ±0.27 25 μmol/L 17.43 ±3.51 3.97 ±0.36 50 μmol/L 42.32 ±4.27 7.85 ±0.17陰性對照組 3 0 μmol/L 1.01 ±0.06 10 μmol/L 2.39 ±1.01 1.48 ±0.32 25 μmol/L 19.28 ±3.59 3.89 ±0.14 50 μmol/L 45.12 ±4.39 7.64 ±0.27 pRNAT-EZH2組 3 0 μmol/L 1.93 ±0.04*10 μmol/L 15.34 ±1.72* 2.17 ±0.03*25 μmol/L 36.49 ±4.13* 4.91 ±0.06*50 μmol/L 67.16 ±4.57* 10.12 ±0.03*

3 討論

膠質(zhì)瘤具有高侵襲性，局部復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移快，并對已知的化療藥物基本耐藥。術(shù)后化療在膠質(zhì)瘤的綜合治療中占有重要地位，多藥耐藥是影響治療效果的重要原因［6，7］。化學(xué)藥物所致細(xì)胞毒作用的終末效應(yīng)均為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［8］，激活細(xì)胞凋亡的能力是抗腫瘤藥物療效的主要檢測標(biāo)準(zhǔn)［9］，由于腫瘤細(xì)胞常存在凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑缺陷，導(dǎo)致許多腫瘤對化療藥物產(chǎn)生耐受［10］。因此通過沉默癌基因及活化凋亡信號關(guān)鍵分子而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，為提高腫瘤化療敏感性提供了新思路。

EZH2是凋亡抑制蛋白家族中一類抑制凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞分化的細(xì)胞因子［2］。目前已有研究發(fā)現(xiàn)在前列腺癌、胃腺、直腸癌等高度惡性轉(zhuǎn)移性腫瘤中EZH2 過度表達(dá)［2，11～14］。RNA 干擾技術(shù)是通過小的雙鏈RNA阻斷體內(nèi)特定基因的表達(dá)，促使mRNA降解，誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失表達(dá)的技術(shù)，是目前沉默某些致病基因功能的高效及特異性手段。本研究構(gòu)建了針對EZH2基因的siRNA真核表達(dá)載體，并用其轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，結(jié)果顯示pRNAT-EZH2轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞后顯著抑制了EZH2 mRNA表達(dá)，提示本研究構(gòu)建的siRNA真核表達(dá)載體的確能夠在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)地表達(dá)siRNA，高效、特異的抑制EZH2基因的表達(dá)。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)空白對照組及陰性對照組細(xì)胞經(jīng)Hoechst 33258染色后，激光共聚焦顯微鏡下呈現(xiàn)的細(xì)胞均勻藍(lán)染，而卡莫司汀組及卡莫司汀加pRNAT-EZH2組細(xì)胞則檢測出明顯的細(xì)胞凋亡，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見濃染致密的顆粒狀藍(lán)色熒光及明顯的熒光碎片，其中可見卡莫司汀加pRNAT-EZH2組細(xì)胞凋亡最多。可以證實(shí)轉(zhuǎn)染EZH2 siRNA促進(jìn)了膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，在與卡莫司汀聯(lián)合作用下，凋亡更加明顯。

本研究結(jié)果顯示，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EZH2 siRNA真核表達(dá)載體后卡莫司汀對細(xì)胞生長抑制作用增加，pRNAT-EZH2轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞后增殖抑制率明顯高于空白對照組和陰性對照組，卡莫司汀加pRNATEZH2組細(xì)胞增殖抑制尤為明顯。Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中Caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能［15］。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 EZH2 siRNA載體后Caspase-3活性明顯升高，以卡莫司汀加pRNAT-EZH2組細(xì)胞升高最為顯著，表明用RNA干擾技術(shù)抑制EZH2表達(dá)造成腫瘤細(xì)胞對卡莫司汀的耐受性降低。

過多表達(dá)EZH2可能并非激活腫瘤細(xì)胞化療藥物的耐受性和抗凋亡能力所必需的因素，但抑制EZH2表達(dá)可能作為有效的調(diào)控信號，提高腫瘤細(xì)胞對卡莫司汀化療敏感性，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。本研究中筆者通過應(yīng)用RNA干擾技術(shù)成功增加了人膠質(zhì)瘤細(xì)胞對卡莫司汀的敏感性，應(yīng)引起重視。

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