師存?zhèn)?，敬曉鵬，冶占福，宋濤

（1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院疼痛科，西寧 810001；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬一院疼痛科，沈陽(yáng) 110001）

腦梗死是臨床常見(jiàn)的、嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的腦血管疾病，其發(fā)病率約占腦血管病的75%，病死率平均10%～15%，致殘率高且易復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)后死亡率大幅度增加［1］。通常顱內(nèi)動(dòng)脈血管堵塞5～10 min就可以引起不可逆性神經(jīng)細(xì)胞壞死，形成“核心區(qū)”，而其周邊組織則處于缺血狀態(tài)，存在不同程度的水腫，細(xì)胞尚未發(fā)生不可逆性壞死，CT檢查表現(xiàn)為“半影區(qū)”，又稱(chēng)“半暗帶”，這部分組織存在缺血—再灌注損傷的風(fēng)險(xiǎn)，是治療的關(guān)鍵點(diǎn)，不恰當(dāng)?shù)闹委熆赡芤l(fā)“遲發(fā)性神經(jīng)元死亡”而影響患者的預(yù)后［2，3］。目前研究顯示，腦缺血-再灌注損傷與自由基的生成、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、興奮性氨基酸毒性、白細(xì)胞高度聚集和高能磷酸化合物耗盡等機(jī)制相關(guān)［4，5］。急性腦梗死的傳統(tǒng)治療包括溶栓、脫水、抗凝、降壓、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)及使用糖皮質(zhì)激素等，這些方法從療效和安全性方面考慮仍存在著不足。上世紀(jì)80年代歐洲首先將臭氧引入臨床治療，在中樞及外周缺血性血管疾病的治療中取得了良好的效果［6］，但是尚缺乏相關(guān)的基礎(chǔ)研究。

腦片培養(yǎng)是近年發(fā)展起來(lái)的一種器官培養(yǎng)方法［7，8］。為了明確臭氧對(duì)急性缺血性神經(jīng)組織損傷的作用，本研究擬采用大鼠離體大腦皮層腦片，建立氧糖剝奪（oxygen and glucose deprivation，OGD）及復(fù)氧的神經(jīng)組織缺血?再灌注損傷模型，研究不同濃度臭氧對(duì)于大鼠離體神經(jīng)組織缺血-再灌注損傷的作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑和器材

雄性SD大鼠（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部），共25只。體質(zhì)量250～300 g，于實(shí)驗(yàn)前3 d領(lǐng)入實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境，每12 h晝-夜交替光照，室溫20℃。自由獲取食物和水。實(shí)驗(yàn)試劑購(gòu)自于Sigma?Aldrich公司（無(wú)錫），主要包括：三（羥甲基）氨基甲烷［Tris（hy?droxymethyl）aminomethane，Tris］、抗壞血酸、丙酮酸鈉、β?煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）、還原型β?煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（β?nicotinamide adenine dinu?cleotide reduced form，NADH）、谷氨酸（glutamate，Glu）、谷 氨 酸 脫 氫 酶（glutamate dehydrogenase，GDH）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、硫巴比妥酸。人工腦脊液（artifi cial cerebrospinal fluid，ACSF）成分：120 mmol/L NaCl，2.5 mmol/L KCl，1.3 mmol/L MgCl2，1.0 mmol/L NaH2PO4，1.5 mmol/L CaCl2，26 mmol/L NaHCO3，11 mmol/L葡萄糖，pH值7.4，滲透壓285～290 mOsmol。4%人血清白蛋白（human serum albumin，HSA，美國(guó) Equitech?Bio公司）；谷氨酸檢測(cè)試劑盒（BioVision，美國(guó)），器材主要包括：活組織切片機(jī)（英國(guó)Gomshall公司）、無(wú)菌插入式培養(yǎng)皿—Millicell?CM insert（上海Millipore）、MEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）、臭氧發(fā)生器（德國(guó)Hu?mares）、分光光度計(jì)（北京普析通用公司）。

1.2 制備腦片并建立模型

參照文獻(xiàn)［8，9］制備腦片并建立模型。大鼠在吸入安氟醚麻醉下迅速斷頭取腦，置入4℃ACSF保存，棄去小腦和腦干、分離雙側(cè)皮層，使用活組織切片機(jī)，沿冠狀面將皮層切開(kāi)，制成350 μm厚度的切片。將制備好的腦片放入無(wú)菌插入式培養(yǎng)皿中，每孔內(nèi)預(yù)先加入2 mL ACSF液并放入2片腦片，將培養(yǎng)皿并放入37℃恒溫培養(yǎng)箱，持續(xù)吹入95%O2+5%CO2的混合氣體60 min，該過(guò)程是為了修復(fù)切片所造成的損傷（恢復(fù)期）；在37℃繼續(xù)孵育30 min，使腦片與外部環(huán)境充分達(dá)到平衡（平衡期）；將培養(yǎng)液迅速更換成由混合氮?dú)猓?5%N2+5%CO2）預(yù)飽和的無(wú)葡萄糖ACSF孵育液（葡萄糖以等摩爾量的蔗糖代替），并持續(xù)吹入95%N2+5%CO230 min，使腦片處于缺糖缺氧狀態(tài)（OGD期）；OGD過(guò)程結(jié)束后，用新鮮的氧氣預(yù)飽和的含葡萄糖ACSF替代缺氧的溶液，繼續(xù)孵育90 min（再灌注期）。臭氧干預(yù)組是在再灌注過(guò)程中，分別向含和不含HAS（150 μg/mL）的ACSF液中持續(xù)加入不同濃度的臭氧和氧氣混合氣。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程是序貫完成的（圖1）。

圖1 實(shí)驗(yàn)程序Fig.1 Scheme of the study

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

將制備好的腦片隨機(jī)挑選分組，每組12片，共分為12組，對(duì)照組（CTRL）、模型組（OGD/R）及臭氧組，臭氧組依據(jù)干預(yù)條件不同分為10個(gè)亞組，具體包括：首先根據(jù)在再灌注期是否向ACSF中加入HSA，分成含HSA（TH）和不含HSA的組（T），再根據(jù)各自接受的不同濃度臭氧干預(yù)分為，10μg/mL組（TH1；T1）、20 μg/mL 組（TH2；T2）、30 μg/mL 組（TH3；T3）、40 μg/mL 組（TH4；T4）和 50 μg/mL 組（TH5；T5）。對(duì)照組全程處于恢復(fù)期狀態(tài)；模型組經(jīng)歷30 min OGD和90 min再灌注。

1.4 臭氧制備

利用高精度的醫(yī)用臭氧儀（德國(guó)HUMAZON公司）獲取臭氧，其濃度范圍為1～56 μg/mL，氣流量0～1 300 mL/min，最小可調(diào)節(jié)濃度為1 μg/mL。臭氧儀需要定期接受“碘量法”濃度校正檢測(cè)，以確保生成臭氧濃度的精確性。臭氧儀需要使用醫(yī)用氧氣而不是過(guò)濾空氣制備臭氧，因?yàn)樵谶^(guò)濾空氣中存在78%的氮?dú)?，并且能自?dòng)生成一氧化氮而干擾實(shí)驗(yàn)。全程使用一次性的硅處理聚丙烯注射器（抗臭氧）和聚乙烯管路以確保臭氧含量和濃度的穩(wěn)定［10］。

1.5 神經(jīng)損傷的評(píng)估

參照文獻(xiàn)［11］，測(cè)量再灌注期內(nèi)ACSF中Glu和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）的含量來(lái)評(píng)估神經(jīng)損傷的程度。利用試劑盒檢測(cè)谷氨酸濃度，試劑盒內(nèi)提供的谷氨酸混合酶試劑能夠特異性識(shí)別Glu為底物，成比例催化產(chǎn)生相應(yīng)顏色變化，因此Glu的含量可以用比色度法來(lái)測(cè)定，用組織濕重（nmol/mg）表示。

LDH作為細(xì)胞內(nèi)標(biāo)志酶，是糖的無(wú)氧酵解和糖異生的重要酶系之一。當(dāng)神經(jīng)元受損、膜通透性改變時(shí)，LDH漏出量明顯增加，是反映神經(jīng)細(xì)胞損傷的可靠生化指標(biāo)，其含量可以利用紫外分光光度法測(cè)定樣本（腦片）在340 nm時(shí)吸收率下降的程度進(jìn)行計(jì)算（U/mg組織濕重），在本研究中將該值與對(duì)照組進(jìn)行比較，并以百分率表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 臭氧對(duì)大鼠腦片OGD和再灌注所致的LDH、Glu釋放的影響

結(jié)果表明，對(duì)照組大鼠腦皮質(zhì)LDH釋放量為（2.24±0.22）U/mg，谷氨酸釋放量為（0.18±0.02）nmol/mg。經(jīng)歷30 min OGD和90 min再灌注后OGD/R組LDH和Glu釋放量明顯增加，分別為（8.31±0.21）U/mg和（0.66±0.04）nmol/mg，與對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＆lt;0.01）。臭氧20，30，40 μg/mL拮抗OGD后再灌注引起的LDH和Glu釋放，40 μg/mL臭氧有明顯的效應(yīng)，LDH和Glu釋放與OGD/R組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＆lt;0.01）。而低濃度（10，20，30 μg/mL）或高濃度（50 μg/mL）臭氧引起的LDH和Glu釋放與OGD/R組比較差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＆gt;0.05），見(jiàn)表1。

表1 臭氧對(duì)大鼠腦片OGD和再灌注所致的LDH、Glu釋放的影響Tab.1 Effects of ozone on oxygen?glucose deprivation and reoxygenation?induced release of glutamate and LDH

2.2 HSA 在臭氧（30，40 μg/mL）作用下對(duì)大鼠腦片OGD和再灌注所致的LDH、Glu釋放的影響

結(jié)果表明，30，40 μg/mL的臭氧能夠明顯減少LDH和Glu釋放，其數(shù)值與對(duì)照組相當(dāng)。LDH釋放量在含有HSA組（30，40 μg/mL臭氧）與不含HSA組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＆lt;0.05）。而Glu釋放量在含有HSA組（30 μg/mL臭氧）處理后下降，與不含HSA組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＆lt;0.05）。見(jiàn)表2。

表2 臭氧和HSA對(duì)大鼠腦片OGD和再灌注所致的LDH、Glu釋放的影響Tab.2 Effects of ozone and HSA on oxygen?glucose deprivation and reoxygenation?induced release of glutamate and LDH

3 討論

臭氧治療缺血性疾?。ㄏ轮珓?dòng)脈硬化閉塞癥、視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈栓塞、急性腦梗死等）具有良好的療效［12，13］。

本研究結(jié)果表明大鼠腦片在經(jīng)歷OGD及再灌注損傷后，LDH與Glu的釋放明顯增加，給予不同濃度臭氧干預(yù)后表現(xiàn)出不同的效應(yīng)，其中40 μg/mL臭氧具有最明顯的抑制效應(yīng)，而低濃度（10～30 μg/mL）或高濃度（50 μg/mL）臭氧都沒(méi)有引起明顯的效應(yīng)。臭氧的拮抗作用表現(xiàn)出倒置的“U型”濃度-效應(yīng)曲線規(guī)律，這與以往的研究一致［14］。

本研究結(jié)果還表明，在ACSF中加入HSA能明顯提高臭氧的拮抗效應(yīng)，這提示臭氧的作用不僅僅是簡(jiǎn)單的物理溶解效應(yīng)，而是與周?chē)橘|(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的結(jié)果。相關(guān)研究顯示［13］用95%氧氣與5%臭氧混合氣處理人血液，氧氣僅僅使血漿含氧量增加以及血紅蛋白發(fā)生充分氧合，而臭氧的作用類(lèi)似于前體藥物，在血漿的液體環(huán)境中臭氧的溶解速度和擴(kuò)散程度比氧氣高，并且能與溶質(zhì)快速發(fā)生反應(yīng)，特別是與水溶性抗氧化劑（尿酸、維生素C、還原型谷胱甘肽等），這些物質(zhì)在ACSF中不存在，因此本研究可能只觀察到了臭氧的一部分作用，這是該離體實(shí)驗(yàn)存在的不足之處，尚需要結(jié)合相關(guān)的在體研究完善對(duì)臭氧作用的認(rèn)識(shí)。

另外，目前所使用的大鼠離體腦片OGD及再灌注損傷模型，理論上僅有切片表面或內(nèi)部表淺組織的表層才能正常利用ACSF，而深層組織似乎無(wú)法與外界環(huán)境充分溝通，但在實(shí)驗(yàn)中我們卻觀察到該離體神經(jīng)組織對(duì)外界不同濃度的臭氧有很好的反應(yīng)性，這提示我們臭氧的作用可能不僅局限在表面接觸。通常，在含水環(huán)境里，臭氧能快速發(fā)生反應(yīng)生成H2O2和烯醛。臨床研究［13］顯示，使用40～50 μg/mL臭氧氣體可以在全血中獲得最佳的臭氧治療濃度，即在1 mL全血（大約600 μL血漿）中溶解的有效臭氧劑量為20～40 μg。因此可以推測(cè)離體的腦組織至少在一定程度上接觸20～40 μmol H2O2和亞微摩爾的烯醛。兩者能夠在腦組織中擴(kuò)散并逆轉(zhuǎn)在“缺血”或OGD 30 min階段時(shí)所造成的損傷。在接受臭氧自體血治療的志愿患者中，合理的H2O2和烯醛濃度能激發(fā)許多有用的生化反應(yīng)，從而發(fā)揮治療作用［16］。

根據(jù)“U型”曲線效應(yīng)，臭氧對(duì)神經(jīng)的保護(hù)作用與濃度相關(guān)，具有典型的“毒物興奮效應(yīng)”特點(diǎn)［15］，即類(lèi)似于“預(yù)處理反應(yīng)”，通過(guò)少量有害刺激，激發(fā)體內(nèi)潛在的防御和修復(fù)能力。許多藥物的濃度/效應(yīng)關(guān)系都表現(xiàn)為這種特異的內(nèi)在趨勢(shì)特點(diǎn)［14］。

綜上所述，在離體腦缺血模型中臭氧具有神經(jīng)保護(hù)作用，且與濃度密切相關(guān)，表現(xiàn)為倒置的“U型”濃度-效應(yīng)曲線。該研究結(jié)論為臭氧的臨床應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)，但是，在臭氧具體作用機(jī)制方面尚需要進(jìn)行更加深入、細(xì)致的研究。

［1］Chen J，Venkat P，Zacharek A.Neurorestorative therapy for stroke［J］.Front Hum Neurosci，2014，27（8）：382-390.

［2］賈革，陳秋惠，張海娜，等.進(jìn)展性卒中相關(guān)危險(xiǎn)因素分析［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2014，14：4110-4113.

［3］Wasser G.Ischemic stroke penumbra and extracorporeal ozone treat?ment［J］.Neuroradiol，2013，26（3）：243-251.

［4］Weinberger JM.Evolving therapeutic approaches to treating acute ischemic stroke［J］.J Neurol Sci，2006（2）：101-109.

［5］Gertz K，Priller J，Kronenberg G，et al.Physical activity improves long?term stroke outcome via endothelial nitric oxide synthase?de?pendent augmentation of neovascularization and cerebral blood flow［J］.Circ Res，2006（99）：1132-1140.

［6］Bocci V，Borrelli E，Travagli V，et al.The ozone paradox：ozone is a strong oxidant as well as a medical drug［J］.Med Res Rev，2009，29（4）：646-682.

［7］Adamchik Y，F(xiàn)rantseva MV，Weisspaph M，et al.Methods to in?duce primal T and secondary traumatic damage in organotypic hip?pocampal slice cultures［J］.Brain Res Brain Res Protoc，2000，5（2）：153-158.

［8］楊麗君，崔紅，楊?lèi)?ài)君，等.大鼠全腦腦片培養(yǎng)及缺氧缺糖模型的建立［J］.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)，2009，29（5）：283-285.

［9］Ricci L，Valoti M，Sgaragli G，et al.Protection by taurine of rat brain cortical slices against oxygen glucose deprivation and reoxygenation?induced damage［J］.Eur J Pharmacol，2009，621（1?3）：26-32.

［10］Travagli V，Zanardi I，Bocci V，et al.Effects of ozone blood treat?ment on the metabolite profile of human blood［J］.Int J Toxicol，2010（29）：165-174.

［11］Ricci L，Valoti M，Sgaragli G，et al.Neuroprotection afforded by di?azepam against oxygen/glucose deprivation?induced injury in ratcortical brain slices［J］.Eur J Pharmacol，2007，561（1?3）：80-84.

［12］張?zhí)m.臭氧自體血回輸治療超急性腦梗塞的臨床及影像學(xué)觀察［J］.中國(guó)社區(qū)醫(yī)師（醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)），2011，13（292）：198-199.

［13］Bocci VA，Zanardi I，Travagli V.Ozone acting on human blood yields a hormetic dose?response relationship［J］.J Trans Med，2011，9：66.

［14］Martínez?Sánchez G1，Pérez?Davison G，Re L，et al.Ozone as u?shaped dose responses molecules（hormetins）［J］.Dose Response，2010，9（1）：32-49.

［15］Calabrese EJ.U?shaped does response in behavioral pharmacology：historical foundations［J］.Crit Rev Toxicol，2008，38（7）：591-598.