劉世萍，柳玉杰，郭美華，白建海，張新建，王琪（.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，哈爾濱5000；.哈爾濱市食品藥品監(jiān)督管理局，哈爾濱 5008；.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科，哈爾濱5000）

穩(wěn)定性試驗(yàn)研究是評價藥品質(zhì)量的主要內(nèi)容之一，在藥品的研究、開發(fā)和注冊管理中占有重要地位。通過穩(wěn)定性試驗(yàn)，考察藥物在不同環(huán)境條件（如溫度、濕度、光線等）下藥品特性隨時間變化的規(guī)律，以認(rèn)識和預(yù)測藥品的穩(wěn)定趨勢，為藥品生產(chǎn)、包裝、貯存、運(yùn)輸條件、有效期的確定提供科學(xué)依據(jù)[1]。復(fù)方鹽酸左氧氟沙星滴眼液系由鹽酸左氧氟沙星、地塞米松磷酸鈉、鹽酸萘甲唑啉3種成分以適當(dāng)比例組方，并輔以氯化鈉及注射用水而制成的眼用制劑，可用于結(jié)膜炎、角膜炎、淚囊炎、白內(nèi)障術(shù)后感染等外眼感染。筆者采用高效液相色譜（HPLC）法測定該制劑中的3種主藥含量，并對其在強(qiáng)光照射及高溫、加速等條件下的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，方法靈敏、準(zhǔn)確、重復(fù)性好。

1 材料

1.1 儀器

Waters 600 HPLC系統(tǒng)，包括2996 PDA檢測器、717自動進(jìn)樣器（美國Waters公司）；SB3200型超聲波儀（上海必能信超聲有限公司）；AE200型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）限公司]。

1.2 藥品與試劑

鹽酸左氧氟沙星對照品（批號：130455-201005，純度：100%）、鹽酸萘甲唑啉對照品（批號：100111-201104，純度：99.2%）、地塞米松磷酸鈉對照品（批號：100016-201015，純度：100%）均來自中國食品藥品檢定研究院；鹽酸左氧氟沙星原料藥（江西大地制藥有限責(zé)任公司，批號：120716-2，純度：97.8%）；鹽酸萘甲唑啉原料藥（天津天成制藥股份有限公司，批號：120308，純度：99.7%）；地塞米松磷酸鈉原料藥（揚(yáng)州制藥有限公司，批號：DL20120039，純度：99.2%）；復(fù)方鹽酸左氧氟沙星滴眼液（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院自制，批號：20120529、20120530、20120531，規(guī)格：5 ml/瓶）；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 處方

鹽酸左氧氟沙星原料藥3 g，地塞米松磷酸鈉原料藥1 g，鹽酸萘甲唑啉原料藥0.25 g，氯化鈉8.5 g，注射用水適量，制成1000 ml。

2.2 制備

稱取處方量鹽酸左氧氟沙星原料藥，加適量注射用水使其溶解，然后分別取處方量地塞米松磷酸鈉、鹽酸萘甲唑啉原料藥和氯化鈉，加適量注射用水使其溶解后加入到上述溶液中，再加注射用水至全量，用G3過濾器過濾，無菌條件下灌封，即可。

2.3 性狀

本品為淡黃色的澄明液體。

2.4 鑒別

在“2.6.1”項(xiàng)色譜條件下，供試品中3種主藥的保留時間與對照品溶液中3種對照品主峰的保留時間分別一致。

2.5 檢查

參照2010年版《中國藥典》（二部）附錄ⅠG眼用制劑[2]項(xiàng)下要求制訂本品的檢查項(xiàng)目，包括pH、滲透壓摩爾濃度、可見異物及無菌等項(xiàng)，均按相關(guān)步驟及原則執(zhí)行。

2.6 含量測定

2.6.1 色譜條件。色譜柱：Kromasil 100-5 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：三乙胺溶液（取三乙胺7.5 ml，加水稀釋至14000 ml，用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.5±0.05）-甲醇-乙腈（50∶45∶5，V/V/V），流速：1.0 ml/min；檢測波長：222 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μl。

2.6.2 溶液的配制。對照品溶液：取鹽酸左氧氟沙星、鹽酸萘甲唑啉及地塞米松磷酸鈉對照品適量，精密稱定，加流動相制成0.1243、0.0113、0.0405 mg/ml的混合對照品溶液，即得。供試品溶液：精密量取本品1 ml，置于25 ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。陰性供試品溶液：分別依次取處方量的除鹽酸左氧氟沙星、鹽酸萘甲唑啉、地塞米松磷酸鈉外的其他成分，按照供試品溶液的制備方法分別制成陰性供試品溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。

2.6.3 方法專屬性。分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性供試品溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10 μl，進(jìn)樣。結(jié)果基線平穩(wěn)，3種主藥及雜質(zhì)峰之間分離度良好（分離度分別為4.0、7.2），各組分之間測定無干擾，柱效高（以鹽酸左氧氟沙星計(jì)理論板數(shù)為2500），峰形理想。

2.6.4 線性關(guān)系考察。取對照品溶液適量，過濾后進(jìn)樣，分別以自動進(jìn)樣器依次進(jìn)樣1、2、4、8、16、20 μl，記錄峰面積。以峰面積響應(yīng)值（y）為縱坐標(biāo)、對照品進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：鹽酸左氧氟沙星y＝5.27×106x－2.66×105（r＝0.99998），線性范圍為0.1243～2.4860 μg；鹽酸萘甲唑啉y＝2.47×107x－3.37×104（r＝0.99996），線性范圍為0.0113～0.2260 μg；地塞米松磷酸鈉y＝2.18×106x－2.52×104（r＝0.99995），線性范圍為0.0113～0.2260 μg。

2.6.5 回收率試驗(yàn)。分別精密量取陰性供試品溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ適量，分成3組，每組3份，每份1 ml，置于25 ml量瓶中，分別精密加入高、中、低3個水平量的鹽酸左氧氟沙星對照品（2.3908、2.9885、3.5862 mg）、鹽酸萘甲唑啉對照品（0.2048、0.2560、0.3072 mg）及地塞米松磷酸鈉對照品（0.8004、1.0005、1.2006 mg），按“2.6.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率。結(jié)果3種主藥平均回收率分別為99.22%（RSD＝0.72%，n＝9）、99.87%（RSD＝0.86%，n＝9）、100.02%（RSD＝0.91%，n＝9）。

2.6.6 精密度試驗(yàn)。取同一份對照品溶液和同一份供試品溶液適量，分別在“2.6.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算峰面積的RSD。結(jié)果3種主藥RSD分別為0.14%和0.32%、0.21%和0.48%、0.45%和0.64%（n＝6），說明精密度良好。

2.6.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)。取同一份供試品溶液適量，分別于0、1、2、4、6、8、10 h進(jìn)樣測定，測定峰面積。結(jié)果RSD 分別為0.41%、0.52%和0.85%（n＝7），可見溶液10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.8 重復(fù)性試驗(yàn)。取同一批樣品，共6份，在“2.6.1”項(xiàng)色譜條件下測定供試品溶液和對照品溶液的峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果3種主藥的平均含量分別為：3.01 mg/ml（RSD＝0.38%，n＝6）、0.255 mg/ml（RSD＝0.47%，n＝6）和1.02 mg/ml（RSD＝0.53%，n＝6）。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)研究

2.7.1 影響因素試驗(yàn)。（1）強(qiáng)光照射試驗(yàn)：取樣品3批，置于密封潔凈容器中，于（4500±500）lx的光照箱內(nèi)考察10 d，分別于第5天及第10天取樣，考察性狀、3種主藥含量等指標(biāo)的變化，詳見表1（表中，＊：表示淡黃色的澄明液體，＊＊：表示黃色的澄明液體，+：表示符合規(guī)定，以下表格同）。

由表1可知，在此條件下樣品的性狀發(fā)生了變化，顏色有所加深，3種主藥的含量均呈下降趨勢，但仍在合格范圍內(nèi)（應(yīng)為標(biāo)示量的90.0%～110.0%），有待進(jìn)一步考察研究。同時提示，本品應(yīng)選擇深色包材，以求遮光。

（2）高溫試驗(yàn)：取樣品3批，置于密封潔凈容器中，置于恒溫培養(yǎng)箱中（40、60℃），考察10 d，分別于第5天及第10天取樣，考察性狀、3種主藥含量等指標(biāo)的變化，詳見表2、表3。

表1 強(qiáng)光照射試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab 1Results of highlight exposure test（n＝3）

表2 高溫試驗(yàn)結(jié)果（40℃，n＝3）Tab 2Results of high temperature test（40℃，n＝3）

表3 高溫試驗(yàn)結(jié)果（60℃，n＝3）Tab 3Results of high temperature test（60℃，n＝3）

由表2、表3可知，在40、60℃的條件下各項(xiàng)指標(biāo)無明顯變化。

2.7.2 加速試驗(yàn)。取樣品3批，不除去外包裝，保持內(nèi)包裝的完整性及密封性，于溫度（40±2）℃、相對濕度（75±5）%的條件下分別放置1、2、3、6個月，按時取樣，考察性狀、3種主藥含量等指標(biāo)的變化。結(jié)果各項(xiàng)指標(biāo)基本穩(wěn)定，詳見表4。

2.7.3 長期試驗(yàn)。取樣品3批，不除去外包裝，保持內(nèi)包裝的完整性及密封性，于溫度（25±2）℃、相對濕度（60±10）%的條件下放置12個月。分別于放置0、3、6、9、12個月時，按時取樣，考察性狀、3種主藥含量等指標(biāo)的變化。結(jié)果各項(xiàng)指標(biāo)未見明顯改變，詳見表5。

3 討論

根據(jù)研究目的和條件的不同，穩(wěn)定性試驗(yàn)研究內(nèi)容可分為影響因素試驗(yàn)、加速試驗(yàn)和長期試驗(yàn)等。影響因素試驗(yàn)是在劇烈條件下探討藥物的穩(wěn)定性、了解影響其穩(wěn)定性的因素及所含成分的變化情況，其為制劑處方設(shè)計(jì)、工藝篩選、包裝材料和容器的選擇、貯存條件的確定、有關(guān)物質(zhì)的控制提供依據(jù)[1]，并為加速試驗(yàn)和長期試驗(yàn)應(yīng)采用的溫度和濕度等條件提供參考。其中，高濕度試驗(yàn)?zāi)康氖强疾旃┰嚻返奈鼭癯苯庑阅?，以吸濕增重的百分比進(jìn)行考察，因本品為液體制劑，所以未進(jìn)行高濕度試驗(yàn)。在強(qiáng)光照射試驗(yàn)中，樣品的性狀發(fā)生了變化，顏色有所加深，3種主藥的含量均呈下降趨勢，但在合格范圍內(nèi)，有待進(jìn)一步考察研究提示本品應(yīng)選擇深色包材，遮光保存。在高溫試驗(yàn)中，40、60℃放置，本品各指標(biāo)無明顯變化，提示本品應(yīng)在低于40℃溫度下保存。

表4 加速試驗(yàn)結(jié)果（40℃，n＝3）Tab 4Results of accelerated test（40℃，n＝3）

表5 長期試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab 5Results of long-term test（n＝3）

加速試驗(yàn)?zāi)康氖窃谳^短的時間內(nèi)，了解制劑的化學(xué)、物理和生物學(xué)方面的變化。本品的各項(xiàng)考察指標(biāo)均無明顯變化，說明本制劑的工藝及包裝等設(shè)計(jì)合理，符合制劑穩(wěn)定性的要求。

長期試驗(yàn)是在接近藥品的實(shí)際貯存條件下進(jìn)行的穩(wěn)定性試驗(yàn)，為制訂藥物的有效期提供依據(jù)。在設(shè)計(jì)的包裝條件下室溫留樣12個月，結(jié)果顯示各項(xiàng)指標(biāo)基本穩(wěn)定，與加速試驗(yàn)結(jié)果一致。所以本包裝能夠保證本產(chǎn)品質(zhì)量，結(jié)合考察結(jié)果，可將本品有效期暫定為1年。

本試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線是用體積定量法（自動進(jìn)樣器）進(jìn)行繪制的。與傳統(tǒng)方法相比較，采用不同體積產(chǎn)生不同響應(yīng)值的辦法獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，簡化步驟，方便快捷；其所獲得曲線的相關(guān)系數(shù)（r）更好，可達(dá)到0.9999以上，曲線標(biāo)準(zhǔn)差（s）更小，精密度更高，更準(zhǔn)確。用新方法定量未知樣品時，采用體積進(jìn)樣，可以根據(jù)需要靈活調(diào)整，不受限制。

綜上，筆者參照文獻(xiàn)[2-5]建立的主藥含量測定方法，簡便易行，方法靈敏、準(zhǔn)確、重復(fù)性好。

[1]郭美華，張新建，馬妍妍，等.安神益心液的穩(wěn)定性考察[J].中國藥師，2011，14（8）：1149.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄9、10、44、75、76、103.

[3]閆瑾，劉美欣，張蕊，等.復(fù)方鹽酸左氧氟沙星丁卡因滴眼液的制備及其質(zhì)量控制[J].中國藥房，2012，23（29）：2729.

[4]胡正波，李航.HPLC法測定鹽酸左氧氟沙星氯化鈉注射液的含量[J].中國藥師，2008，11（1）：108.

[5]蔡佳玉，孫樹茂，孟永春，等.HPLC測定微球中鹽酸左氧氟沙星的含量[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2012，29（5）：437.