馮悅?cè)A 羅光華△ 陳立新

高胰島素-正血糖鉗夾技術(shù)（HEC）是評(píng)價(jià)胰島素敏感性的金標(biāo)準(zhǔn)[1-2]。國(guó)內(nèi)關(guān)于此技術(shù)應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（大鼠）的報(bào)道目前為止大多可分兩類，一類是在術(shù)后麻醉狀態(tài)下進(jìn)行，或者是術(shù)后第2天清醒狀態(tài)下進(jìn)行，但麻醉或術(shù)后造成的胰島素抵抗影響極大[3]；另一類研究的比較多，是給大鼠尾動(dòng)靜脈插管而行替代實(shí)驗(yàn)，避免大范圍損傷但需長(zhǎng)期維持局部麻醉，目前未被國(guó)際廣泛認(rèn)可。本研究根據(jù)國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)合實(shí)際操作方法建立了大鼠清醒狀態(tài)下的HEC技術(shù)，并且通過(guò)給正常大鼠短期輸注脂肪乳，初步建立脂毒性胰島素抵抗模型，從而為研究脂毒性胰島素抵抗提供客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)備 選用250～300 g的SPF級(jí)雄性SD大鼠10只，購(gòu)置并飼養(yǎng)在中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，條件：12 h明暗交替，室溫22～25℃，濕度40%～70%。動(dòng)物購(gòu)入后適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，期間飼以基礎(chǔ)飼料，自由攝食飲水。

在正式開始鉗夾實(shí)驗(yàn)7 d前，10%水合氯醛麻醉大鼠，行左頸動(dòng)脈-右頸靜脈插管術(shù)。在無(wú)菌狀態(tài)下切開頸部皮膚，鈍性分離皮下組織和肌肉，暴露右側(cè)頸靜脈和左側(cè)頸動(dòng)脈。硅膠管2根（內(nèi)徑0.5 mm），經(jīng)50 IU/mL肝素化處理，分別植入頸動(dòng)、靜脈。靜脈導(dǎo)管置于右心房水平，動(dòng)脈導(dǎo)管置于主動(dòng)脈弓水平，2根導(dǎo)管均經(jīng)皮下隧道延至頸背部引出，見圖1。導(dǎo)管用生理鹽水（含50 IU/mL的肝素）沖洗，最后用500 IU肝素和300 g/L的PVP-10聚乙烯吡咯烷黏稠溶液封管。術(shù)后單籠飼養(yǎng)。大鼠術(shù)后恢復(fù)1周，待體質(zhì)量恢復(fù)、活動(dòng)如初時(shí)進(jìn)行清醒狀態(tài)下脂肪乳輸注和HEC實(shí)驗(yàn)，見圖2。

Figure 1 Rats with catheterizing in the right jugular vein and left carotid artery圖1 大鼠左頸動(dòng)脈及右頸靜脈置管圖

Figure 2 The experimental figure of fat emulsion infusion and hyperinsulinemic-euglycemic clamp in rats圖2 大鼠脂肪乳輸注和高胰島素-正常血糖鉗夾實(shí)驗(yàn)圖

1.2 大鼠脂肪乳輸注合并HEC實(shí)驗(yàn) 大鼠隔夜禁食12 h，以隨機(jī)數(shù)字表法分為2組，每組5只。對(duì)照組頸內(nèi)輸注5%葡萄糖加肝素鈉（葡萄糖購(gòu)于華裕制藥有限公司，肝素鈉購(gòu)于常州千紅生化制藥股份有限公司），脂肪乳組頸內(nèi)輸注20%脂肪乳加肝素鈉（20%脂肪乳購(gòu)于華瑞制藥有限公司）。

2組大鼠分別從頸動(dòng)脈抽取血液，羅氏羅康全活力血糖儀測(cè)定基礎(chǔ)血糖（BBG）。然后分別通過(guò)頸靜脈持續(xù)輸注20%脂肪乳加肝素和5%葡萄糖加肝素6 h，20%脂肪乳或5%葡萄糖輸注率為10 mL·kg-1·h-1，合并肝素（速率為0.097 5 IU/min），并在最后90 min引入HEC實(shí)驗(yàn)。HEC實(shí)驗(yàn)開始后，在輸注原液體的同時(shí)恒定輸注胰島素10 mU·kg-1·min-1，之后每5 min測(cè)定血糖1次。當(dāng)血糖值低于5.0 mmol/L時(shí)開始輸注20%葡萄糖（購(gòu)于Amresco公司），調(diào)整葡萄糖輸注速率使血糖控制在5.0～6.0 mmol/L左右。取穩(wěn)定狀態(tài)及以后的血糖值的均數(shù)為穩(wěn)定血糖濃度（SBG）。記錄穩(wěn)態(tài)下連續(xù)3～5次葡萄糖輸注速率，其均值即為此大鼠的葡萄糖輸注率（Glucose infusion rate，GIR）[1]。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將大鼠處死，取肝組織凍于液氮中備用。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，2組間的比較采用t檢驗(yàn)，Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組穩(wěn)定血糖濃度比較 2組間BBG和SBG波動(dòng)在6.30 mmol/L和5.55 mmol/L左右，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05），見表1。

Table 1 Comparison of basal glucose and SBG data between two groups表1 2組初始血糖和穩(wěn)定血糖濃度比較 （mmol/L，x±s）

2.2 脂肪乳輸注對(duì)血漿FFA、GIR影響 大鼠輸注20%脂肪乳6 h后，血漿FFA水平升高到對(duì)照組（輸注5%葡萄糖）的17.6倍（t=11.20,Plt;0.01），見圖3，GIR下降了27%（t=3.987,Plt;0.01），見圖4。

Figure 3 Effects of intralipid-infusin on plasma FFA in rats圖3 脂肪乳輸注對(duì)大鼠血漿FFA的影響

Figure 4 Effects of intralipid-infusin on GIR in rats圖4 脂肪乳輸注對(duì)大鼠GIR的影響

3 討論

自1983年Kraegen等[4]建立大鼠高胰島素-正血糖鉗夾技術(shù)以來(lái)，國(guó)外已經(jīng)廣泛使用，成為研究胰島素抵抗的基本技術(shù)之一。但在國(guó)內(nèi)未能普遍使用，原因主要是傳統(tǒng)的HEC技術(shù)需要在大鼠體內(nèi)留置導(dǎo)管1周以避免術(shù)后應(yīng)激，雖然結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但是術(shù)后感染、大鼠咬斷導(dǎo)管，尤其是導(dǎo)管堵塞等問(wèn)題常導(dǎo)致整個(gè)實(shí)驗(yàn)失敗。也有人用麻醉狀態(tài)下頸動(dòng)靜脈或者股動(dòng)靜脈插管術(shù)進(jìn)行鉗夾實(shí)驗(yàn)，但麻醉狀態(tài)下血糖濃度顯著升高，大腦及骨骼肌糖利用減少，胰島素拮抗激素分泌增加，本身存在胰島素抵抗[5]，不能真實(shí)反映大鼠體內(nèi)實(shí)際情況，所以必須保證大鼠在清醒狀態(tài)下施行HEC技術(shù)。針對(duì)上述問(wèn)題，本研究嘗試將傳統(tǒng)方法進(jìn)行完善：一是手術(shù)操作中對(duì)組織的損傷盡可能減小，穿刺時(shí)盡量避開肉眼可見血管，以防頸部出血壓迫窒息；二是改變封管的方法，用500 IU肝素和300 g/L的PVP-10聚乙烯吡咯烷黏稠溶液封管1周后再通的概率能提高70%～80%。兩方面聯(lián)合改進(jìn)，降低了實(shí)驗(yàn)成本，增強(qiáng)了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)穩(wěn)定性。因此，本改進(jìn)方法具有一定可行性和可靠性。胰島素抵抗是2型糖尿病的特征，研究表明血漿FFA濃度增加在胰島素抵抗的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用[6]。國(guó)內(nèi)多采用高脂喂養(yǎng)方式制備脂毒性大鼠胰島素抵抗模型，但長(zhǎng)期高脂飲食可刺激大鼠代償性分泌一些胃腸激素激活脂蛋白酯酶（LPS），從而減輕胰島素抵抗[7]。不同于此種方法，筆者采用短期6 h輸注脂肪乳使FFA升高，直接觀察高FFA對(duì)大鼠胰島素敏感性的影響，同時(shí)采用經(jīng)典的HEC技術(shù)評(píng)價(jià)胰島素抵抗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠輸注20%脂肪乳6 h后，血漿FFA水平升高17.6倍，同時(shí)GIR下降了27%，成功復(fù)制了大鼠脂毒性胰島素抵抗模型。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之前通過(guò)輸注脂肪乳從而建立胰島素抵抗模型的數(shù)據(jù)基本一致[8]。

[1]Gan KX,Wang C,Chen JH,et al.Mitofusin-2 ameliorates high-fat diet-induced insulin resistance in liver of rats[J].World J Gastroen?terol,2013,19(10):1572-1581.

[2]Camacho RC,Zafian PT,Achanfuo-Yeboah J,et al.Pegylated Fgf21 rapidly normalizes insulin-stimulated glucose utilization in diet-induced insulin resistant mice[J].Eur J Pharmacol,2013，715（1-3）：41-45.

[3]李玲.大鼠清醒和麻醉狀態(tài)下胰島素鉗夾實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較[J].中國(guó)糖尿病雜志,2003,11(1):51-53.

[4]Kraegen EW,James DE,Bennett SP,et al.In vivo insulin sensitivi?ty in the rat determined by euglycemic clamp[J].Am J Physiol,1983,245(1):E1-7.

[5]羅四川,李啟富,劉紅梅.清醒狀態(tài)大鼠高胰島素一正常血糖鉗夾術(shù)的建立及其意義[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2004,29(3):334-336.

[6]Capurso C，Capurso A.From excess adiposity to insulin resistance:the role of free fatty acids[J].Vascul Pharmacol,2012,57(2-4):91-97.

[7]Calanna S,Urbano F,Piro S,et al.Elevated plasma glucose-depen?dent insulinotropic polypeptide associates with hyperinsulinemia in metabolic syndrome[J].Eur J Endocrinol,2012,166(5):917-922.

[8]Griffin ME,Marcucci MJ,Cline GW,et al.Free fatty acid-induced insulin resistance is associated with activation of protein kinase C theta and alterations in the insulin signaling cascade[J].Diabetes,1999,48(6):1270-1274.