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自噬抑制劑促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的大鼠乳鼠心肌細(xì)胞凋亡

2014-12-07 08:05:08王路喬黃茶花程曉曙
關(guān)鍵詞:乳鼠節(jié)律心肌細(xì)胞

王路喬,黃 波,黃茶花,王 伶,程曉曙*

自噬(autophagy)是將細(xì)胞內(nèi)受損、變性或衰老的蛋白質(zhì)以及受損細(xì)胞器運(yùn)輸?shù)饺苊阁w進(jìn)行消化降解的過(guò)程,是一種廣泛存在的正常生理過(guò)程和防御機(jī)制。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)心肌缺血缺氧都能誘發(fā)細(xì)胞自噬發(fā)揮心肌保護(hù)作用[1-2]。然而,缺氧過(guò)程誘發(fā)自噬增強(qiáng)是否能通過(guò)下調(diào)促凋亡蛋白Bim和caspase-3表達(dá),抑制凋亡從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用呢?目前這一機(jī)制還不十分明確。另外,近年來(lái)研究證實(shí)缺氧或缺血過(guò)程中自噬的誘導(dǎo)激活涉及到低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)的調(diào)控[3],那么缺氧過(guò)程自噬的心肌保護(hù)作用是否與HIF-1的調(diào)控有關(guān)呢?

1 材料與方法

1.1 SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞分離與培養(yǎng)

新生1~3 d Spradgue-Dawley乳鼠(南昌大學(xué)動(dòng)物科學(xué)實(shí)驗(yàn)部),75%乙醇浸泡數(shù)秒后,取出心臟剝除心外膜及多余組織,剪成1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm大小的組織塊,0.08%胰蛋白酶和10%膠原酶37℃ CO2培養(yǎng)箱中消化2 h,離心重懸細(xì)胞,200目濾網(wǎng)過(guò)濾后差速貼壁2 h,將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中。24 h后第1次換液,一般培養(yǎng)至第4天時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)前給細(xì)胞換液。

1.2 缺氧模型建立及分組

將原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞置于缺氧盒中通入含95%N2,5%CO2的混合氣體30 min驅(qū)除缺氧小盒中的空氣后,轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中,分別缺氧0、2、4、8、14和24 h,取LC3-Ⅱ/Ⅰ(自噬標(biāo)志物)表達(dá)顯著增高時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞,缺氧前1 h加入終濃度為10 mmol/L的3MA預(yù)處理心肌細(xì)胞抑制自噬過(guò)程,即缺氧+3MA(anoxia+3MA)組,同時(shí)設(shè)立對(duì)照組(control)和單純?nèi)毖踅M(anoxia)。

1.3 藥物及試劑

3-甲基腺嘌呤(3MA)(Sigma公司)。兔來(lái)源Bim(Cell singaling公司),caspase-3(Santa Cruz公司),HIF-1(Proteintech 公司),兔抗鼠的 β-actin,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(中杉金橋生物公司),化學(xué)發(fā)光劑(Thermo Scientific公司)。

1.4 細(xì)胞搏動(dòng)頻率、異常節(jié)律和乳酸脫氫酶LDH活性的檢測(cè)

倒置顯微鏡下連續(xù)觀察60 s,評(píng)測(cè)各組心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率和節(jié)律的變化。取各組中培養(yǎng)液500μL,南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科測(cè)定乳酸脫氫酶LDH活性。

1.5 Western blot蛋白印跡

收集各組心肌細(xì)胞,總蛋白提取試劑盒提取各組細(xì)胞總蛋白。13%凝膠SDS-PAGE分離蛋白,電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,加入5%牛血清白蛋白稀釋的兔抗Bim多克隆抗體(1∶1 000)4℃孵育過(guò)夜,caspase-3多克隆抗體(1∶1 000),HIF-1 多克隆抗體(1∶800),再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的小鼠抗兔IgG(1∶5 000)雜交1 h。ECL顯色液顯色,膠片曝光,ImageTool分析軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各缺氧時(shí)間點(diǎn)心肌細(xì)胞自噬程度的變化

LC3-Ⅱ/Ⅰ反映自噬程度[2]。缺氧 8 h 后LC3-Ⅱ/Ⅰ較對(duì)照組顯著升高(p<0.05),缺氧24 h后 LC3-Ⅱ/Ⅰ最大 (圖1,表1)。

2.2 抑制自噬后心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率、異常節(jié)律和LDH活性的變化

正常心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率相近,節(jié)律規(guī)整;缺氧8 h后細(xì)胞搏動(dòng)頻率下降,幅度減弱,異常搏動(dòng)增加。抑制自噬后細(xì)胞搏動(dòng)頻率顯著降低,異常搏動(dòng)增加,極不規(guī)律,且LDH活性明顯增加(p<0.05)(表2)。

圖1 缺氧模型中不同時(shí)間點(diǎn)心肌細(xì)胞自噬程度的變化Fig 1 Changes of degree of autophagy in anoxia model in cardiac myocytes for different times

表1 缺氧模型中不同時(shí)間點(diǎn)LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的吸光度值Table 1 The average optical density(A)value in anoxia model in cardiac myocytes for different times,n=3)

表1 缺氧模型中不同時(shí)間點(diǎn)LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的吸光度值Table 1 The average optical density(A)value in anoxia model in cardiac myocytes for different times,n=3)

*P < 0.05 compared with control.

anoxia 2 hours 4 hours 8 hours 14 hours 24 hours LC3-ⅠAOD value control 10±0.5 8±0.3 9±0.1 3±0.1 1±0.1 1±0.1 LC3-Ⅱ 25±1 24±1 24±1 23±1* 10±1* 18±1*

表2 各組心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率和異常節(jié)律的變化Table 2 The changes of beating rate and arrhythmin cardiac myocytes,n=3)

表2 各組心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率和異常節(jié)律的變化Table 2 The changes of beating rate and arrhythmin cardiac myocytes,n=3)

*P <0.05 compared with control;#p<0.05 compared with anoxia.

group beating rate(times/min)arrhythm of cells(times/min)LDH(U/L)control 185±5 7±2 81±12 anoxia 103±7* 18±3* 146±20*anoxia+3MA 45±6# 50±6# 210±29#

2.3 Western blot檢測(cè)各組中 LC3-Ⅱ/Ⅰ、Bim、caspase-3和HIF-1的表達(dá)情況

缺氧后 LC3-Ⅱ/Ⅰ較對(duì)照組明顯增強(qiáng)(p<0.05);自噬抑制后LC3-Ⅱ/Ⅰ較單純?nèi)毖踅M明顯減弱(P <0.05)(圖2,表3)。

圖2 3MA抑制缺氧誘導(dǎo)的自噬Fig 2 3MA inhibits autophagy induced by anoxia

表3 各組中LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的吸光度值Table 3 The average optical density(A)value in control,anoxia and anoxia+3MA group,n=3)

表3 各組中LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的吸光度值Table 3 The average optical density(A)value in control,anoxia and anoxia+3MA group,n=3)

*P <0.05 compared with control;#P <0.05 compared with anoxia.

expression of protein control anoxia anoxia+3MA LC3-Ⅰ20±2 22±3 21±2 LC3-Ⅱ 2±0.1 9±0.3* 5±0.1#

缺氧后促凋亡蛋白Bim和caspase-3表達(dá)較對(duì)照組顯著上調(diào)(p<0.05),而抑制自噬后Bim和caspase-3表達(dá)較單純?nèi)毖踅M顯著增加(p<0.05);缺氧刺激顯著上調(diào)HIF-1表達(dá)(p<0.05),抑制自噬后HIF-1表達(dá)較單純?nèi)毖踅M明顯下降。(圖3)。

3 討論

自噬是維持自穩(wěn)、保證生存的重要生理過(guò)程之一,自噬在缺血性心臟病中的作用一直是研究探索的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了心肌細(xì)胞缺氧模型,缺氧8 h自噬顯著增強(qiáng)。研究表明缺血誘導(dǎo)的自噬具有心肌保護(hù)作用。例如,大鼠急性心肌缺血模型中,電鏡下觀察到缺血心肌組織中有自噬泡形成,增強(qiáng)自噬后心肌梗死面積顯著減少,并在梗死邊緣存活的心肌組織內(nèi)看到大量自噬泡[4],其可能機(jī)制是:缺血導(dǎo)致AMP/ATP比值升高激活A(yù)MPK,降解無(wú)功能的蛋白質(zhì)、脂肪酸等物質(zhì)為細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)和能量[5];也有研究證實(shí)可能是自噬增強(qiáng)后清除受損線粒體減少Cytc釋放,從而延遲或者抑制凋亡,發(fā)揮心肌保護(hù)作用[6]。

圖3 各組中促凋亡蛋白Bim、caspase-3和HIF-1的表達(dá)Fig 3 The protein expression of Bim,caspase-3 and HIF-1 in control,anoxia and anoxia+3MA group

然而,很少有研究探索缺氧過(guò)程中自噬的心肌保護(hù)作用與下調(diào)促凋亡蛋白Bim和caspase-3表達(dá)抵抗凋亡有關(guān)。在心肌細(xì)胞中,主要涉及到受體介導(dǎo)的外凋亡途徑和線粒體介導(dǎo)的內(nèi)凋亡途徑[7-8]。Bim屬于BCL-2家族中的一員,作為促凋亡蛋白介導(dǎo)線粒體凋亡途徑[9]。caspase屬半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶家族,是內(nèi)外凋亡途徑的交匯點(diǎn),其中caspase-3則是凋亡的最終執(zhí)行者[10]。3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3MA)是一種廣泛運(yùn)用的自噬抑制劑[1],本實(shí)驗(yàn)中3MA顯著抑制缺氧誘發(fā)的自噬,這一結(jié)果也支持先前的研究[11]。本研究表明,缺氧誘發(fā)自噬下調(diào)促凋亡蛋白Bim和caspase-3表達(dá)發(fā)揮抗凋亡作用,而一旦抑制自噬后顯著減弱這種自噬的心肌保護(hù)作用。

此外,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索了缺氧誘導(dǎo)自噬發(fā)揮抗凋亡作用中,HIF-1的正調(diào)控作用。HIF-1是一種在缺氧缺血過(guò)程中由低氧刺激激活的轉(zhuǎn)錄因子。先前的研究證實(shí),在腎臟、腦組織和癌細(xì)胞中,HIF-1都能調(diào)控缺氧誘導(dǎo)的自噬,其可能機(jī)制是HIF-1能介導(dǎo)BCL-2和BNIP3相互作用,導(dǎo)致選擇性的線粒體自噬,或者通過(guò)抑制m-TOR誘發(fā)自噬[12]。本研究證實(shí),HIF-1正調(diào)控大鼠乳鼠心肌細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)的自噬發(fā)揮抗凋亡作用,而這一心肌保護(hù)機(jī)制有望成為缺血性心臟病治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。但心肌缺血過(guò)程中HIF-1精細(xì)調(diào)控細(xì)胞自噬的機(jī)制及其上游信號(hào)調(diào)控分子還不十分明確,我們?cè)谙乱徊綄⑦M(jìn)行更具體的研究和探索。

[1] Nishida Y,Arakawa S,F(xiàn)ujitani K,et al.Discovery of Atg5/Atg7-independent alternative macroautophagy[J].Nature,2009,461:645 -658.

[2]Przyklenk K,Undyala VV,Wider J,et al.Acute induction of autophagy as a novel strategy for cardioprotection:getting to the heart of the matter[J].Autophagy,2011,7:432-433.

[3]Zhang H,Bosch-Marce M,Shimoda LA,et al.Mitochondrial autophagy is an HIF-1-dependent adaptive metabolic response to Anoxia[J].JBiol Chem,2008,283:10892-10903.

[4]Zhang J L,Lu J K,Chen D,et al.Myocardial autophagy variation during acute myocardial infarction in rats:The effects of carvedilol[J]. Chin Med J,2009,122:2372-2379.

[5]Busss J,Riffel Jh,Katusha,et al.Augmentationof autophagy by mTOR-inhibition in myocardial infarction:When sizematters[J].Autophagy,2010,6:304 -306.

[6]Mccormick J,Suleman N,Scarabelli TM,et al.STAT1 deficiency in the heart protects against myocardial infarction by enhancing autophagy[J].J Cell Mol Med,2012,16:386-393.

[7]戴日新,李浪.心肌細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路與心肌損傷[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2010,30:775-777.

[8] Crow MT,Mani K,Nam YJ,et al.The mitochondrial death pathway and cardiac myocyte apoptosis[J].Circ Res,2004,95:957-70.

[9]Youle,RJ,Strasser A.The BCL-2 protein family:opposing activities that mediate cell death[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2008,9:47 -59.

[10]Stennicke HR,Salvesen GS.Caspases-controlling intracellular signals by protease zymogen activation[J].Biochim Biophys Acta,2000,1477:299-306.

[11]Zhang Zl,F(xiàn)an Y,Liu Ml.Ginsenoside Rg1 inhibits autophagy in H9c2 cardiomyocytes exposed to Anoxia/reoxygenation[J].Mol Cell Biochem,2012,365:243-250.

[12]Pouyssegur J,Dayan F,Mazure NM.Anoxia signalling in cancer and approaches to enforce tumour regression[J].Nature,2006,441:22-45.

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