潘永平，龔 輝，邱夢(mèng)標(biāo)，樊曉慧，毛紅霞，熊水印，粟慶娟

(南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院感染科，江西南昌330003)

肝細(xì)胞癌是人類最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，癌細(xì)胞的生物學(xué)特征是多種原癌基因的激活、抑癌基因的失活及一系列復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制失常所致的生長(zhǎng)失控。其主要分子機(jī)制是細(xì)胞周期紊亂和凋亡過(guò)少。P27kip1是一種細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制劑，可將細(xì)胞阻滯于G1期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)P27kip1在多種腫瘤組織中表達(dá)量降低［1］，且在腫瘤細(xì)胞中，P27kip1減少的程度與細(xì)胞DNA損傷的程度有一定的關(guān)系［2］。因此，P27kip1途徑可能成為腫瘤診斷［3］和治療的新的靶點(diǎn)。

為了研究肝癌細(xì)胞中的P27kip1的表達(dá)情況，并考查外源導(dǎo)入P27kip1對(duì)肝癌細(xì)胞的影響，為基于P27kip1的腫瘤治療研究提供理論依據(jù)，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了載有P27kip1基因的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，篩選出了可穩(wěn)定產(chǎn)生病毒的PA317包裝細(xì)胞，構(gòu)建了過(guò)表達(dá)P27kip1的 HepG2細(xì)胞，并檢測(cè)了過(guò)表達(dá) P27kip1對(duì)HepG2細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料

pLNCX質(zhì)粒、攜帶有人 P27kip1基因的 pUC18-P27質(zhì)粒、DH5α菌種、PA317細(xì)胞、HepG2細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室提供。質(zhì)粒提取試劑盒(上海生工生物工程有限公司)。HindⅢ、ClaⅠ限制性內(nèi)切酶、Taq酶(Promega公司)，DMEM、FCS、胰蛋白酶、Lipofectamine-2000轉(zhuǎn)染試劑盒、G418(Gibco公司)。鼠抗人P27kip1抗體(Santa Cruz公司)。

1.2 構(gòu)建p LNCX-P27質(zhì)粒

分別用HindⅢ及ClaⅠ酶切pUC18-P27質(zhì)粒及pLNCX質(zhì)粒，用T4連接酶將兩者定向連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌，提取 pLNCX-p27質(zhì)粒，經(jīng)HindⅢ及ClaⅠ雙酶切鑒定。

1.3 轉(zhuǎn)染PA317細(xì)胞

采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將15μL的重組pLNCX-p27質(zhì)粒轉(zhuǎn)染反轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞 PA317，同時(shí)以空pLNCX載體作為對(duì)照組。轉(zhuǎn)染48 h后，胰蛋白酶消化細(xì)胞，培養(yǎng)液中加入300μg/L G418進(jìn)行篩選，每3～4 d換液1次，G418濃度逐漸增加至500μg/L，3周后獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆。對(duì)穩(wěn)定克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，部分凍存，部分繼續(xù)在50 mL培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，細(xì)胞鋪滿后按1∶3的比例傳代，并更換不含G418的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，收集上清液，離心、0.22μm濾膜過(guò)濾后－70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 測(cè)定病毒滴度

檢測(cè)前24 h傳代 HepG2細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)60%～70%匯合度時(shí)，取保存的病毒上清液加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液，并以102、103和104倍稀釋，稀釋液分別加入HepG2細(xì)胞中，2.5 h后加入含有500μg/L G418及10%FCS的 DMEM培養(yǎng)液，每3～4 d換液1次，維持G418濃度不變，3周后計(jì)數(shù)抗性克隆數(shù)。病毒滴度=平均抗性克隆數(shù)×病毒液稀釋倍數(shù)。

1.5 感染HepG2細(xì)胞

HepG2細(xì)胞以5×105個(gè)接種于250 mL培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿瓶底約70%時(shí)，加入pLNCX-P27病毒懸液，另設(shè)對(duì)照組加入pLNCX空載體病毒液;同時(shí)加入聚凝胺至終濃度6 mg/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后按1∶5傳代，24 h后加入G418至終濃度500 mg/L進(jìn)行篩選，3周后對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，建立HepG2-P27細(xì)胞系及對(duì)照組HepG2-pLNCX細(xì)胞系。

1.6 Western blot檢測(cè)

裂解液破裂細(xì)胞，離心后取上清，檢測(cè)總蛋白濃度，取50μg蛋白進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳，電泳之后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，加一抗于37℃孵育30 min，洗滌后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗于37℃孵育30 min，化學(xué)發(fā)光法顯色拍照。

1.7 MTT

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)增殖期的細(xì)胞，設(shè)HepG2-P27細(xì)胞組、HepG2-pLNCX對(duì)照組和HepG2細(xì)胞空白對(duì)照組，每組24個(gè)復(fù)孔，常規(guī)消化記數(shù)后，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至3×107按200μL每孔接種于96孔板，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，每3天換1次液。每24 h各取3個(gè)復(fù)孔進(jìn)行檢測(cè)，連續(xù)8 d。檢測(cè)前4 h每孔加入MTT 20μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜100μL/孔，振蕩15 min后，用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)A490nm值。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡

HepG2-p27細(xì)胞及常規(guī)HepG2細(xì)胞各設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞，用 PBS制成2×108/L的單細(xì)胞懸液，用FCM流式細(xì)胞儀進(jìn)行PI單色熒光細(xì)胞流式計(jì)數(shù)，觀察G1期、S期和G2期細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)。用Annexin V/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

2 結(jié)果

2.1 反轉(zhuǎn)錄病毒載體p LNCX-P27的構(gòu)建

構(gòu)建的含有 P27kip1基因的反轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX-P27，經(jīng)HindⅢ、ClaⅠ酶切，可出現(xiàn)594 bp的條帶(圖1)，證明目的基因插入正確，載體構(gòu)建成功。

2.2 病毒滴度檢測(cè)

收集包裝細(xì)胞產(chǎn)生的病毒液，計(jì)算pLNCX-P27病毒液滴度為2.9×104CfU/mL，對(duì)照組pLNCX空載體病毒液滴度為3.2×104CfU/mL。

2.3 Western blot結(jié)果

HepG2-P27組細(xì)胞中可高表達(dá)P27kip1蛋白，而空載體病毒及HepG2空白對(duì)照組中僅有微量P27kip1蛋白表達(dá)(圖2)，證明構(gòu)建的反轉(zhuǎn)錄病毒pLNCX-P27可將P27kip1基因?qū)爰?xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)。

圖1 p LNCX-P27質(zhì)粒HindⅢ/ClaⅠ雙酶切鑒定Fig 1 pLNCX-P27 vector digested by HindⅢand ClaⅠ

圖2 P27kip1在HepG2中的表達(dá)Fig 2 Expression of P27kip1 in HepG2

2.4 P27kip1對(duì)Hep G2細(xì)胞形態(tài)的影響

正常HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，鏡下可見(jiàn)較多分裂相，細(xì)胞倍增快;而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與對(duì)照組相比，增生效慢，且出現(xiàn)較多凋亡細(xì)胞:細(xì)胞體積明顯縮小，胞核固縮，胞質(zhì)中有空泡形成(圖3)。

2.5 P27kip1對(duì)Hep G2生長(zhǎng)速度的影響

與pLNCX空質(zhì)粒組相比，pLNCX-P27組可明顯抑制HepG2細(xì)胞的增長(zhǎng)(p＜0.01)，而pLNCX組與HepG2空白對(duì)照組無(wú)差異(圖4)。

2.6 P27kip1對(duì)Hep G2細(xì)胞周期的影響

導(dǎo)入P27kip1基因的HepG2-P27組處于G1期的細(xì)胞明顯高于對(duì)照組(p＜0.01)，而處于S期的細(xì)胞顯著減少(p＜0.01)(圖5)。

圖3 P27kip1對(duì)HepG2生長(zhǎng)形態(tài)的影響Fig 3 Effect of P27kip1 on Hep G2 morphology(×100)

圖4 P27kip1對(duì)HepG2生長(zhǎng)速度的影響Fig 4 Effect of P27kip1 on HepG2 growth

圖5 P27kip1對(duì)Hep G2細(xì)胞周期的影響Fig 5 Effect of P27kip1 on the cell cycle of Hep G2

圖6 P27kip1對(duì)Hep G2細(xì)胞凋亡的影響Fig 6 Effect of P27kip1 on apoptosis of Hep G2

2.7 P27kip1對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響

HepG2空白對(duì)照組、HepG2-pLNCX對(duì)照組與HepG2-P27三組細(xì)胞的凋亡比率依次為(6.32±1.16)%，(6.90±0.93)%和(27.85±4.42)%，空白對(duì)照組與空質(zhì)粒對(duì)照組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，導(dǎo)入P27kip1基因的 HepG2-P27組則明顯高于對(duì)照組(p＜0.01)(圖6)。

3 討論

腫瘤細(xì)胞的永生化和分裂失控是腫瘤細(xì)胞惡性增生的根本原因，而細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白在正常細(xì)胞的生長(zhǎng)和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。真核細(xì)胞的細(xì)胞周期由一系列的細(xì)胞周期素(cyclins)和細(xì)胞周期素依賴性激酶(cyclin dependent kinases，CDKs)的有序激活和失活調(diào)控，而細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制劑(cyclin-dependent-kinase inhibitors，CKIs)是細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控因子［4］。P27kip1是 CKIs的主要成分之一，主要抑制細(xì)胞周期蛋白E-CDK2和細(xì)胞周期蛋白D-CDK4等G1期激酶復(fù)合物，使細(xì)胞不能通過(guò)G1期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。人為地減少P27蛋白的表達(dá)，可使正常細(xì)胞出現(xiàn)惡性傾向［5］，而增加其表達(dá)則可使某些腫瘤細(xì)胞惡性表現(xiàn)逆轉(zhuǎn)。

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了含人P27kip1的重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體，導(dǎo)入 PA317細(xì)胞，篩選出了穩(wěn)定產(chǎn)生病毒的PA317-P27細(xì)胞，并用病毒成功感染HepG2細(xì)胞，經(jīng)克隆化培養(yǎng)，成功建立了過(guò)表達(dá)P27kip1的肝癌細(xì)胞模型，并證實(shí)過(guò)表達(dá)的P27kip1將細(xì)胞阻滯于G1期，并通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等機(jī)制抑制 HepG2的生長(zhǎng)。

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