周 煒，陳 玲，周 逸，陳曼華

心肌細胞凋亡是引起心肌梗死后心功能不全、心室重塑及心律失常的重要原因［1］。目前發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物可通過原癌基因Ras法尼基化的相關機制誘導磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositide 3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號通路激活，發(fā)揮其調節(jié)細胞增殖和凋亡、心肌保護等調脂外作用［2－3］。線粒體融合素 2(mitofusin 2，Mfn2)是利用差異顯示法從自發(fā)性高血壓大鼠體內克隆獲得的基因，其表達產(chǎn)物可負向調控PI3K/Akt信號通路，誘導細胞凋亡［4］。目前關于他汀類藥物對Mfn2的調節(jié)作用尚不明確。因此，本實驗建立大鼠急性心肌梗死模型，觀察阿托伐他汀對心肌細胞凋亡及Mfn2表達的影響，進一步闡明其抗心肌細胞凋亡的機制，為其臨床應用提供新的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

凋亡檢測(TUNEL)試劑盒(Roche公司);Mfn2抗體(Abcam 公司)，p-Akt抗體、Akt抗體、α-肌動蛋白(α-actin)抗體和辣根過氧化物酶標記的二抗(Cell signaling公司)。免疫組化試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液(武漢博士德公司);阿托伐他汀(阿斯利康制藥有限公司)。其他的試劑采用國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 實驗分組

SPF級雄性SD大鼠48只，體質量(250±30)g(華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心)，動物許可證號:【SYXK(鄂)2009-0049】。實驗分為假手術組(sham);心肌梗死組(myocardial infarction，MI);阿托伐他汀1組(statin 1);阿托伐他汀2組(statin 2)，共4組，每組12只。Statin 1組和statin2組術前7 d開始每日灌胃，給予阿托伐他汀10和40 mg/kg，劑量的選擇參考文獻［5］。Sham組及MI組予等量蒸餾水灌胃。

1.3 建立大鼠心肌梗死模型

參照文獻［1］進行。腹腔注射3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉大鼠，小動物呼吸機鼻面罩輔助通氣。開胸后分離胸膜、心包，在左心耳下緣、肺動脈圓錐水平結扎左前降支。造模成功的標準為:1)心電圖標準II導聯(lián)ST段呈弓背向上型抬高，2)結扎動脈遠端心肌出現(xiàn)蒼白。假手術組開胸后于左前降支下穿線，不結扎。各組存活至術后24 h的動物數(shù)量分別為sham 組(12只)，MI組(9只)，statin 1組(10只)，statin 2組(10只)。處死大鼠后取心臟標本，4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水，石蠟包埋后切片。

1.4 TUNEL染色檢測心肌細胞凋亡

按試劑盒操作說明染色，以細胞質染成棕黃色為陽性，每張切片在梗死邊緣區(qū)域(假手術組在左室前壁)隨機取5個高倍鏡視野，記錄陽性細胞數(shù)，計算凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)，AI(%)=凋亡細胞質數(shù)/總細胞質數(shù)×100%，每張切片取5個視野求均值。

1.5 免疫組化法檢測Mfn2蛋白表達

按試劑盒說明操作檢測Mfn2蛋白表達。每張切片在梗死邊緣區(qū)域(假手術組在左室前壁)隨機選取5個高倍鏡視野，虛擬顯微鏡拍攝圖像，使用Image pro-Plus圖像分析軟件測定Mfn2蛋白表達平均吸光度值(mean absorbance)。

1.6 免疫印跡法檢測p-Akt的表達

提取組織總蛋白，測定蛋白濃度。蛋白上樣量為50μg，經(jīng)電泳、轉膜、封閉后，將膜在一抗(抗β-actin、抗p-Akt、抗Akt)中4℃孵育過夜。緩沖液洗脫后放入辣根過氧化物酶標記的二抗中室溫孵育2 h后進行檢測。Quantity One軟件測定條帶吸光度值，進行半定量分析。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 各組心肌細胞凋亡的分布

凋亡細胞質呈棕黃色，正常細胞質呈藍色。Sham組心肌細胞未見明顯凋亡;與MI組比較，阿托伐他汀1組、2組AI均顯著下降(p＜0.05)，且阿托伐他汀2組較1組AI降低更顯著(p＜0.05)(圖1，表1)。

2.2 各組心肌組織Mfn2蛋白的表達

Sham組未見明顯心肌梗死區(qū)域，Mfn2蛋白少量表達;與sham組比較，MI組在心肌梗死邊緣區(qū)域Mfn2蛋白表達顯著增加(p＜0.01);與MI組比較，阿托伐他汀1組和2組Mfn2表達顯著降低(p＜0.05)，且阿托伐他汀2組較1組表達更低(p＜0.05)(圖2，表1)。

圖1 各組TUNEL染色結果Fig 1 Comparison of TUNEL staining results among 4 groups(×400)

表1 各組凋亡指數(shù)、p-Akt以及Mfn2吸光度值的比較Table 1 Comparison of the apoptosis index，the mean absorbance of p-Akt and Mfn2 among 4 groups，%，n=6)

表1 各組凋亡指數(shù)、p-Akt以及Mfn2吸光度值的比較Table 1 Comparison of the apoptosis index，the mean absorbance of p-Akt and Mfn2 among 4 groups，%，n=6)

*P ＜0.01 compared with sham;△P ＜0.05 compared with MI;#P ＜0.05 compared with statin 1．

group apoptosis index mean absorbance of Mfn2 mean absorbance of p-Akt sham 0.00±0.00 8.14±1.34 82.34±5.12 MI 61.32±6.37* 49.52±3.29* 9.57±0.19*statin 1 37.24±3.56＊△ 33.61±2.07＊△ 17.25±1.42＊△statin 2 24.49±3.14＊△# 24.18±1.93＊△# 25.31±2.55＊△#

圖2 各組免疫組化染色結果Fig 2 Comparison of immunohistochemical staining results among 4 groups(×200)

2.3 各組心肌組織p-Akt的表達

與sham組比較，MI組心肌組織中p-Akt蛋白表達顯著降低(p＜0.01);與MI組比較，阿托伐他汀1和2組p-Akt表達顯著上升(p＜0.05)，且阿托伐他汀2組較1組表達更高(p＜0.05)(圖3;表 1)。

3 討論

心肌細胞凋亡是急性心肌梗死早期細胞丟失的重要形式，Ras-PI3K/Akt信號通路是促發(fā)心肌細胞凋亡的關鍵路徑［6］。通過藥物或基因治療干預凋亡相關基因的表達，調控細胞內信號傳導通路，抑制細胞凋亡，有可能成為防治心肌梗死的有效手段［7］。

圖3 各組免疫印跡法檢測結果Fig 3 Comparison of Western blot results among 4 groups

他汀類藥物是廣泛應用于臨床的調脂藥物，具有多重調脂以外的作用。研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物通過抑制甲羥戊酸合成，使其下游的焦磷酸法尼酯和焦磷酸牛兒基牛兒酯減少，阻礙小三磷酸鳥苷結合蛋白Ras、Rho、Rac等異戊二烯化，影響 Ras-PI3K/Akt及絲裂原活化的蛋白激酶信號通路，具有抗氧化應激及抗炎等調脂外作用［2－3，8］。本研究發(fā)現(xiàn)，術前7天開始每日給予阿托伐他汀可顯著抑制大鼠急性心肌梗死后的細胞凋亡，且具有一定的劑量依賴性。

Mfn2是一種線粒體外膜蛋白，對線粒體形態(tài)及功能有重要的調節(jié)作用［4］。Mfn2也是細胞凋亡信號通路中一個新的調控點。該基因是原癌基因Ras的直接負調控因子，能夠與其相互作用，阻滯Ras-PI3K/Akt信號通路，抑制 Akt磷酸化，進而減少BCL-2蛋白表達，增加Bax蛋白表達，通過線粒體途徑誘導細胞凋亡［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠發(fā)生急性心肌梗死后，局部組織Mfn2表達顯著增高，p-Akt表達顯著降低，表明Akt磷酸化受到抑制，提示缺血缺氧損傷激活了Mfn2的表達，從而促發(fā)心肌細胞凋亡增加。而阿托伐他汀干預則可顯著下調Mfn2表達，進而促進Akt磷酸化，抑制心肌細胞凋亡，作用呈一定的劑量依賴性。

初步結果顯示，Mfn2基因可能是大鼠心肌梗死過程中一個重要的促凋亡基因，參與阿托伐他汀抑制心肌梗死后細胞凋亡的過程，也是阿托伐他汀發(fā)揮其心肌保護作用的一個重要靶基因，其具體機制有待進一步研究。

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