趙 麗，景蓉蓉，張魯榕，俞榮華

循環(huán)游離 DNA(circulating free DNA，cf-DNA)是一種無細胞狀態(tài)的胞外DNA，廣泛存在于血液(血清或血漿)、滑膜液和腦脊液等體液中。近來的研究表明在創(chuàng)傷、腫瘤、自身免疫性疾病和炎性反應(yīng)等病理過程中可檢測到cf-DNA的改變［1］。血液不同于其他體液，來源于全身各處，因而對血 cf-DNA含量進行準(zhǔn)確定量具有重要意義。

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)患者具有發(fā)病急、并發(fā)癥多、病死率高等特點［2－3］。隨著生物醫(yī)學(xué)的進步，心臟的生物學(xué)標(biāo)志物如肌鈣蛋白 I(cTnI)、肌酸激酶同功酶 MB(CK-MB)和肌紅蛋白(MYO)等已廣泛應(yīng)用于AMI的診斷。然而，現(xiàn)有的心臟生物學(xué)標(biāo)志物也存在一定的缺點，如cTnI窗口期長而診斷再梗死以及判斷梗死范圍的能力差等。因此，人們?nèi)栽诓粩嗟奶剿魈禺愋?、敏感性及診斷價值更高的心臟生物學(xué)標(biāo)志物。目前國內(nèi)未見AMI患者血cf-DNA含量的相關(guān)報道。本研究擬采用分支 DNA(branched DNA，bDNA)信號放大的定量檢測技術(shù)建立檢測血中cf-DNA-ALU含量的方法，并對其進行方法學(xué)評價，初步應(yīng)用于AMI患者的檢測。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

實驗組:2010年5月至2011年8月在南通大學(xué)附屬醫(yī)院就診的82例AMI患者(年齡40～85歲，男性50例，女性32例)。符合美國心臟病學(xué)會/美國心臟協(xié)會2007診斷標(biāo)準(zhǔn)確診為AMI。排除標(biāo)準(zhǔn):1)既往有AMI史;2)合并慢性心功能不全、外傷、腫瘤、肺栓塞、中風(fēng)、心肌病、肝臟疾病、腎臟疾病及免疫系統(tǒng)疾病;3)正在上述疾病治療中。對照組:60名在南通大學(xué)附屬醫(yī)院體檢中心的健康成人。本研究中，所有受試對象均匿名。本研究經(jīng)南通市第四人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。對照組血液標(biāo)本于清晨采血。AMI組于胸痛發(fā)作6 h內(nèi)采血。均采集肘靜脈血2 mL。將采集的肘靜脈血2 mL，立即置于肝素抗凝管中，4 000 r/min離心5 min，取血漿置于離心管，－80℃凍存。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

針對ALU基因的捕獲輔助探針(capture extender，CE)、標(biāo)記輔助探針(labeled extender，LE)和封閉探針(Blocking probe，BL)由美國羅切斯特大學(xué)放射腫瘤系張魯榕教授提供。裂解液、含捕獲探針的96孔板、前放大探針和放大探針、堿性磷酸酶標(biāo)記探針(Panomics公司)。人類基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品(Promega公司)。cTnI、CK-MB和MYO檢測試劑盒(上海藍怡公司)。

1.3 bDNA技術(shù)檢測血ALU基因含量的基本原理

將捕獲探針固化在96孔板上，CE一端與靶序列結(jié)合，另一端與捕獲探針結(jié)合;LE一端與靶序列結(jié)合，樣本其余位點用BL封閉;LE的另一端接前放大探針，再接放大探針，每個放大探針上可接堿性磷酸酶標(biāo)記探針。通過與底物反應(yīng)，使得檢測敏感性更高。

1.4 bDNA技術(shù)檢測血ALU基因含量的步驟

血漿標(biāo)本用雙蒸水1∶20稀釋后，置95℃加熱5 min，冰水即刻冷卻。取90μL探針工作液(裂解液、TE緩沖液、蛋白酶 K、BL、CE和 LE組成)和10μL DNA樣本(樣本、質(zhì)控品雙份測定，標(biāo)準(zhǔn)品3份測定)加入包被了捕獲探針的96孔反應(yīng)板。錫泊紙封閉微孔板，立即放入雜交爐55℃雜交1 h。每孔加入300μL洗滌液洗板3次后各孔加1∶1 000稀釋的前放大探針100μL，55℃孵育30 min;同樣洗板后，每孔加1∶1 000稀釋的放大探針100μL，55℃孵育30 min和1∶1 000稀釋的標(biāo)記探針50℃孵育30 min。再次洗板后每孔加100μL底物工作液，室溫下孵育5～10 min后，在發(fā)光儀讀每孔吸光度(A)值，求每樣本的平均值，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度和A值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算每樣本稀釋后的ALU含量，將結(jié)果乘以20即得每樣本的ALU的含量。

1.5 bDNA技術(shù)檢測血ALU基因含量的方法學(xué)評價

將購買的人類基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品進行2倍系列稀釋(濃度依次為 400、200、100、50、25、12.5、6.25和0 ng/mL)，以不同濃度的人類基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)濃度標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度為縱坐標(biāo)，建立了檢測ALU的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

以濃度分別為20、100和200 ng/mL的DNA標(biāo)準(zhǔn)液，同一批重復(fù)做12個測定，計算批內(nèi)CV值;連續(xù)測定12 d，以每個濃度12個測定結(jié)果計算批間CV值。

在ALU含量為50 ng/mL的樣品中取0.9 mL溶液分別加入濃度為50、100、200和400 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL進行回收實驗。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

用Sigmaplot 11.0軟件進行統(tǒng)計分析。ALU含量用中位數(shù)(四分位區(qū)間)［M(P25～P75)］表示。AMI組和正常對照組 ALU含量比較用 Student's paired-sample t檢驗。批內(nèi)、批間不精密度用變異系數(shù)(CV)表示。0.99，斜率=1779(圖1)。以空白檢測結(jié)果的均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差為本方法的最低檢測限，濃度為0.86 ng/mL。該方法的批內(nèi) CV為 7.85% ～11.75%，批間CV為10.05% ～14.32%(表1)。加入濃度50、100、200和400 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液后回收率為106.01%、96.33%、104.03%和93.35%。

2.2 ALU在健康對照組和AMI組中的含量

用建立的 bDNA技術(shù)檢測。82例 AMI患者ALU的含量(中位數(shù)4 223 ng/mL，四分位數(shù)區(qū)間2 285～7 864 ng/mL)遠高于60例健康對照組者(中位數(shù)118 ng/mL，四分位數(shù)區(qū)間81～218 ng/mL)(P ＜0.0001)。

2.3 AMI患者ALU含量和心肌標(biāo)志物的相關(guān)性分析

82例 AMI患者血漿 cTnI、CK-MB和 MYO與ALU表達量無相關(guān)性(圖2)。

2.4 血漿ALU含量對AMI診斷效能的評價

本研究對AMI患者ALU含量結(jié)合健康對照組作ROC曲線，其曲線下的面積分別為0.99，敏感度98.8%，特異性100.0%，診斷界值631 ng/mL(圖3)。

圖1 bDNA技術(shù)檢測ALU方法的線性Fig 1 The linearity of bDNA-based ALU assay

2 結(jié)果

2.1 bDNA技術(shù)檢測血中ALU基因含量的方法學(xué)評價

標(biāo)準(zhǔn)品濃度在0～400 ng/mL內(nèi)成線性，R2=

圖2 血漿ALU含量與cTnI、CK-MB、MYO相關(guān)性分析Fig 2 Correlation of ALU with troponin I，CK-MB and MYO

表1 批內(nèi)和批間變異Table 1 Intra-assay variation and Inter-assay variation(x ± s，n=12)

圖3 ALU診斷急性心肌梗死的ROC曲線Fig 3 ROC curve for ALU in order to diagnose AMI

3 討論

目前，國內(nèi)外應(yīng)用較多的是實時熒光定量PCR方法檢測cf-DNA含量，但由于外周血中cf-DNA含量極其微弱，提取的DNA濃度和純度總是達不到理想的效果而且費時、價格相對較高［4－5］。本研究選取ALU基因建立一種類似“酶聯(lián)免疫吸附法”的檢測手段-bDNA技術(shù)檢測血cf-DNA的含量。ALU家族是靈長類基因組特有的含量豐富的中度重復(fù)序列，人類基因組全部基因的3/4都和ALU有關(guān)。bDNA技術(shù)不同于PCR技術(shù)，是一種雜交基礎(chǔ)上的信號放大系統(tǒng)。選擇ALU基因并結(jié)合bDNA技術(shù)可提高cf-DNA檢測的敏感度［6］。本檢測方法一個測試僅需要10μL血漿，極大簡化操作步驟。

血cf-DNA的含量與AMI的關(guān)系如何?本研究中AMI組ALU含量遠高于健康對照組，這與通過染料法定量 AMI患者血 cf-DNA的結(jié)果一致［7］。ROC分析顯示血ALU的診斷敏感度和特異度顯著高于血cTnI、CK-MB和MYO。這表明血中ALU的定量檢測對AMI的輔助診斷有一定的價值。血cTnI、CK-MB和MYO是臨床常用的心肌診斷標(biāo)志物，但通過相關(guān)性分析未發(fā)現(xiàn)與血cf-DNA相關(guān)性，可能的原因是這些指標(biāo)的生物半衰期不同，在發(fā)病的6 h內(nèi)尚未達到最高峰。

總之，本研究應(yīng)用bDNA技術(shù)定量檢測血ALU的含量，具有靈敏、重復(fù)性好、線性范圍寬等優(yōu)點，并用該方法首次證實了AMI患者中ALU含量增加，但ALU能否作為AMI早期診斷指標(biāo)以及與疾病進程的關(guān)系仍需擴大樣本量并進行動態(tài)的觀察研究。

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