成志勇，王亞麗，王鳳云，韓 英，谷 蕾，梁麗青，謝旭磊

浸潤與轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要生物學特征。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及金屬基質(zhì)蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)相互影響、相互作用下，促進了腫瘤細胞的浸潤及轉(zhuǎn)移［1－2］。

PTEN(phosphatase and tensin hemology deleted on chromosome ten gene)基因是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第一個編碼蛋白具有蛋白磷酸酶及脂質(zhì)磷酸酶雙重活性的抑癌基因，PTEN低表達、缺失及突變等均可影響其抑制腫瘤生長、浸潤和侵襲功能。其主要通過對細胞內(nèi)多種信號傳導通路的調(diào)控，參與抑制腫瘤細胞的侵襲、浸潤及轉(zhuǎn)移［3－4］。實驗通過對髓系白血病細胞的研究，探討PTEN對髓系白血病細胞中VEGF及MMP相互作用的影響。

1 材料與方法

1.1 研究資料與對象

1.1.1 主要試劑:反轉(zhuǎn)錄反應體系、SYBR Green Real Master Mix(北京天根);PTEN、VEGF鼠抗人單克隆抗體(Santa Cruz公司);明膠(石家莊博海)。

1.1.2 臨床資料:慢性髓系白血病患者來源于保定市第一醫(yī)院血液科及河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院，符合WHO診斷標準。10例慢性期 CML患者(CMLCP)，其中男6例，女4例，中位年齡為39歲(25～67歲);10例急變期CML患者(CML-BC)，男5例，女5例。中位年齡為40歲(27～65);10例健康志愿者作為正常對照(NC)。所有患者均獲得倫理委員會的審查批準，同時簽署知情同意書。

1.1.3 腺病毒載體:含有野生型PTEN基因腺病毒(Ad-PTEN-GFP)和空載體腺病毒(Ad-GFP)，在人胚腎細胞系293A細胞中進行擴增及滴度測定。

1.1.4 細胞系:人胚腎細胞系293A細胞用含10%胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，人慢性髓系白血病K562細胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞均在37℃，5%CO2的飽和濕度環(huán)境孵育。

1.2 方法

1.2.1 病毒轉(zhuǎn)染:按感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為200，在100μL無血清培養(yǎng)液混合病毒液后，加入 K562細胞，37℃，5%CO2培養(yǎng)2 h，加入含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，流式細胞儀檢測表達綠色熒光蛋白細胞比例，并計算轉(zhuǎn)染效率。

1.2.2 實時熒光定量PCR(FQ-RTPCR):收集以不同MOI轉(zhuǎn)染3 d的K562細胞，PBS清洗2次備用。Trizol提取細胞總RNA，電泳鑒定、定量，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。SYBR反應體系共25μL，反應條件為94 ℃ 5 min、94 ℃ 45 s、60 ℃ 1 min，30 個循環(huán)，同時設空白對照。PCR反應前3～15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，調(diào)節(jié)基線至適宜處，各熒光曲線與基線交叉點的循環(huán)數(shù)即為Ct值。根據(jù)公式△Ct=Ct目的基因－ Ctβ-actin和△△Ct=2－△Ct，計算檢測基因的mRNA相對表達量，每組重復3次并取平均值。所檢測目的基因 PTEN、VEGF、MMP-2、MMP-9和β-actin的相關(guān)PCR引物序列見表1。

1.2.3 Western blot:收集各組細胞，每組1×107細胞，加入200μL預冷的蛋白裂解液4℃裂解1 h，冰浴下超聲裂解15 min。4℃ 12 000 r/min離心20 min，上清用考馬斯亮藍測定蛋白濃度，置－20℃保存。取80μg樣品蛋白質(zhì)加入等體積上樣緩沖液，經(jīng)5%濃縮膠和10%SDS-PAGE凝膠電泳后，用水浴式電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。經(jīng)5%牛血清白蛋白37℃封閉1 h，分別加入小鼠抗人單克隆抗體(Santa Cruz，USA)，4℃孵育過夜。TBS漂洗5 min×3次，加入山羊抗小鼠HRP標記二抗，37℃孵育1 h，TBS漂洗5 min×3次?；瘜W發(fā)光法檢測后分析結(jié)果。

表1 FQPCR擴增引物序列Table 1 Primer sequence of FQPCR

1.2.4 細胞生長抑制實驗(MTT法):取100μL對數(shù)增殖期細胞，接種5 000個細胞/孔于96孔板，每組3個復孔。分為對照組、Ad-GFP組、Ad-PTENGFP 組，以 MOI=200，轉(zhuǎn)染細胞。在培養(yǎng)后 0、2、3、4、5和7 d，不同時間點每孔加入噻唑藍(MTT)溶液(5 g/L)10μL，37℃孵育4 h后離心棄培養(yǎng)液，另加入二甲基亞砜(DMSO)100μL振蕩15 min，酶標儀檢測每孔A490值，計算不同組對K562細胞生長抑制率，繪制生長抑制曲線。

1.2.5 細胞侵襲實驗:將50 mg/L的Matrigel 4℃融化，用無血清RPMI 1640培養(yǎng)基將其1∶8稀釋混勻。200μL包被Transwell小室聚碳酸脂膜上室面，4℃風干。

將不同組細胞加入無血清培養(yǎng)基孵育12 h。取1×105細胞加入800μL無血清培養(yǎng)基中，加入0.1%的牛血清白蛋白維持滲透壓，放入transwell小室上層。下室加入含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基1 000μL，孵育24h。取出Transwell小室，用下室培養(yǎng)液反復淋洗，將脫落及淋洗下來的細胞在倒置顯微鏡下計數(shù)熒光細胞數(shù)量。整個操作過程在冰上及無菌條件下進行并重復試驗3次。

1.2.6 明膠酶譜檢測 MMP-2，MMP-9:取15μL培養(yǎng)上清在非變性條件下進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，80 mg/mL的聚丙烯酰胺凝膠中含2 mg/mL明膠。電泳結(jié)束，將凝膠置2.5%的Triton X-100中復性45 min，再置于孵育液(含50 mmol/L Tris/HCl pH 8.0，50 mmol/L NaCl，10 mmol/L CaCl2)37℃作用12 h。用0.5%考馬斯亮藍染色并用30%甲醇，10%乙酸脫色，膠上的亮帶即為明膠酶活性部位。adobe photoshop軟件分析條帶。

1.3 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)用SAS 8.0統(tǒng)計軟件分析處理，計量資料以均值±標準差)表示，進行方差分析、t檢驗、χ2檢驗及相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 PTEN、VEGF、MMP-2和 MMP-9 mRNA 在CML骨髓單個核細胞中的表達

在CML-BC中PTEN mRNA表達最低，與CMLCP及NC比較，表達水平有顯著性差異(p＜0.01)，而后二者差異無顯著性。

VEGF、MMP-2、MMP-9 mRNA 在 CML-BC 患者中表達水平均最高(p＜0.05)，其次為CML-CP，在NC中表達水平最低(表2)。

2.3 PTEN mRNA及蛋白檢測

以MOI=200轉(zhuǎn)染K562細胞72 h，流式細胞儀檢測腺病毒感染K562細胞效率為(81.2±5.4)%(圖1A)。

表2 PTEN、VEGF、MMP-2、MMP-9 mRNA在CML及對照組中的表達差異Table 2 The PTEN，VEGF，MMP-2，MMP-9 mRNA expression levels in different groups of CML(x±s，n=10)

圖1 K562細胞轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染PTEN基因3 d后綠色熒光表達及PTEN mRNA、蛋白及Akt、VEGF蛋白表達水平Fig 1 The expression of green flourescence and PTEN mRNA，protein and Akt and VEGF protein in K562 cells transfected with or without PTEN gene

轉(zhuǎn)染3 d，PTEN mRNA及蛋白表達水平達到最高，與細胞綠色熒光蛋白表達率一致。轉(zhuǎn)染3 d，Ad-PTEN-GFP組PTEN表達mRNA水平(23.58±4.52)及蛋白表達水平(0.912±0.102)均高于Ad-GFP組的mRNA(0.650±0.516)及蛋白(0.117±0.028)表達水平和未轉(zhuǎn)染對照組的mRNA(0.575±0.226)及蛋白(0.086±0.021)表達水平，(p＜0.01)(圖1B)。

2.4 細胞生長抑制實驗

以MOI=200轉(zhuǎn)染K562細胞后第4～7天細胞增殖抑制率出現(xiàn)明顯區(qū)別，在第5天細胞生長抑制率最大為38.6%，Ad-GFP與Ad-PTEN-GFP組比較(p＜0.01)(圖2)。

圖2 不同轉(zhuǎn)染組K562細胞增殖抑制曲線圖Fig 2 K562 cells growth inhibiting curve of different transfection group

2.5 細胞侵襲實驗

以MOI=200轉(zhuǎn)染K562細胞后，未轉(zhuǎn)染組、Ad-GFP組和Ad-PTEN-GFP組的漏出具有熒光細胞的數(shù)量分別為199±33、182±28和20±5(p＜0.01)，以Ad-PTEN-GFP組漏出綠色熒光細胞數(shù)量最少。

2.6 K562細胞中PTEN對p-Akt影響

細胞內(nèi)總Akt表達水平無明顯變化，而p-Akt表達水平明顯減低，與轉(zhuǎn)染Ad-GFP組比較降低96.15%(圖1B)。

2.7 K562細胞中PTEN基因?qū)EGF、MMP-2及MMP-9基因及蛋白表達的影響

以MOI=200轉(zhuǎn)染K562細胞系3 d，Ad-PTENGFP組 PTEN mRNA表達水平為 MOI=0時的41.01倍，VEGF mRNA表達水平降低 79.12%，MMP-2 mRNA降低82.99%，MMP-9表達水平降低82.52%(表3)。Pearson直線相關(guān)法分析顯示，隨著感染復數(shù)的增加PTEN mRNA表達水平逐漸增加，VEGF、MMP-2、MMP-9 mRNA 表達水平逐漸減低，呈負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r分別為(r=－0.903p＜0.05)、(r=0.998p＜0.05)和(r= －0.901p＜0.05)，而 VEGF mRNA表達水平與 MMP-2及MMP-9表達水平呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為:(r=0.998，P ＜0.05)及(r=0.991，P ＜0.05)。

以MOI=200轉(zhuǎn)染K562細胞系3 d，顯示轉(zhuǎn)染Ad-PTEN-GFP組VEGF蛋白表達水平明顯減低(p＜0.05)(圖1B)。明膠酶譜檢測試驗顯示，轉(zhuǎn)染Ad-PTEN-GFP組MMP-2和MMP-9蛋白表達水平明顯低于未轉(zhuǎn)染組和Ad-GFP組(p＜0.05)(圖3)。與轉(zhuǎn)染Ad-GFP組比較VEGF、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平分別降低80.88%、65.03%、78.99%。

表3 以不同感染復數(shù)轉(zhuǎn)染K562 PTEN基因3 d后PTEN、VEGF、MMP-2和MMP-9 mRNA表達水平變化Table 3 PTEN，VEGF，MMP-2，MMP-9 mRNA expression levels after 3days of transfection Ad-PTEN-GFP into K562 cells with different MOI，n=3)

表3 以不同感染復數(shù)轉(zhuǎn)染K562 PTEN基因3 d后PTEN、VEGF、MMP-2和MMP-9 mRNA表達水平變化Table 3 PTEN，VEGF，MMP-2，MMP-9 mRNA expression levels after 3days of transfection Ad-PTEN-GFP into K562 cells with different MOI，n=3)

.581±4.522 33.342±2.011 VEGF mRNA 0.418±0.029 0.375±0.026 0.189±0.017 0.087±0.007 0.063±0.006 MMP-2 mRNA 1.224±0.201 0.981±0.085 0.501±0.079 0.208±0.038 0.099±0.011 MMP-9 mRNA 0.681±0.210 0.519±0.181 0.301±0.103 0.MOI gene 0 50 100 200 400 PTEN mRNA 0.575±0.226 1.312±0.210 6.103±0.732 23 119±0.051 0.081±0.021

圖3 不同組轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染3 d后MMP-2，MMP-9明膠酶譜檢測蛋白的表達差異Fig 3 The expression levels of MMP-2，MMP-9 mRNA and protein in K562 cells transfected with or without PTEN gene

3 討論

腫瘤血管新生是指腫瘤細胞通過分泌多種促血管生長因子誘導血管生成，從而促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移［5］。其中主要包括VEGF、血管生成素、環(huán)氧化酶以及多種 MMP［1，6－7］。

VEGF及其受體是腫瘤血管新生、侵襲的主要調(diào)控因子，VEGF特異性地作用于血管內(nèi)皮細胞，具有強烈的促進血管生成作用，并增加血管通透性。進一步可以促進血管內(nèi)皮細胞分泌表達MMP-2、MMP-9，而增強腫瘤細胞的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移能力［1－2］。MMP在降解基質(zhì)過程中亦能夠促進血管生成因子如VEGF的釋放，并促進腫瘤的血管新生，產(chǎn)生腫瘤轉(zhuǎn)移的血行通路［1－2］，二者形成反饋作用。

本研究顯示在髓系白血病中均存在VEGF、MMP-2及MMP-9異常表達，在進展期白血病，如慢性髓系白血病急變期VEGF及MMP-2、MMP-9表達水平明顯增加，表明二者與疾病進展密切相關(guān)。

研究顯示抑癌基因PTEN在造血系統(tǒng)腫瘤如白血病、骨髓瘤［6－8］中存在不同程度的缺失或低表達。PTEN表達缺失或突變可以導致多種促血管新生因子的表達增加，促進腫瘤血管的新生，增強腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［6－7，9－10］。本研究結(jié)果表明，CML急變期患者較慢性期患者PTEN表達水平明顯減低，而VGEF、MMP表達水平明顯升高，促進CML細胞增殖、血管新生，細胞侵襲性增加，從而導致疾病進展。

PI3K/Akt信號通路激活后，能夠促進VEGF合成［11－12］，VEGF 與其 受體結(jié) 合后能 夠反 饋 激活PI3K。PI3K/Akt及VEGF活化后進一步促進MMP表達，介導腫瘤細胞浸潤及轉(zhuǎn)移。PTEN基因通過抑制PI3K/Akt信號活化，抑制VEGF、MMP等多種促血管新生因子的合成［13－14］。本研究顯示，K562細胞轉(zhuǎn)染野生型PTEN基因后，細胞增殖受抑，侵襲性減低，PI3K/Akt信號通路受抑，VEGF及MMP-2、MMP-9表達水平明顯減低，PTEN與VEGF及MMP表達呈負相關(guān)。

上述研究顯示髓系白血病患者PTEN表達的減低，導致 VEGF及 MMP表達增強。PTEN/PI3K/Akt/VEGF/MMP信號傳導通路相互聯(lián)系、相互作用，參與了髓系白血病血管新生、侵襲及轉(zhuǎn)移。

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