韓長(zhǎng)志

摘要：希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsanum Sacc.）可以侵染菜心、蘿卜等眾多十字花科蔬菜引起炭疽病，給生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。通過對(duì)該菌中可能的腺苷酸環(huán)化酶（AC）氨基酸序列進(jìn)行理化性質(zhì)、細(xì)胞信號(hào)肽、跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)以及二級(jí)結(jié)構(gòu)等生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，該菌種ChCap1，ChCap2與Srv2在理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位方面差異較大，以期為深入開展AC基因的定位、表達(dá)以及功能域等方面研究及為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)以控制病原菌G蛋白信號(hào)途徑功能新藥物靶標(biāo)的開發(fā)提供有力的理論支撐。

關(guān)鍵詞：希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsanum Sacc.）;腺苷酸環(huán)化酶;理化性質(zhì);亞細(xì)胞定位;二級(jí)結(jié)構(gòu)

中圖分類號(hào)：S763 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2014）20-4992-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.20.061

Bioinformatics Analyses of Adenylate Cyclase of Colletotrichum higginsianum

HAN Chang-zhi

（College of Forestry， Southwest Forestry University/The Key Laboratory of Forest Disaster Warning and Control

of Yunnan Province， Kunming ?650224， China）

Abstract：Colletotrichum higginsianum can infect flowering Chinese cabbage， carrot and other cruciferous vegetables， causing huge economic losses to the production. Based on our previous research， bioinformatics analyses of the typical adenylate cyclase （AC） sequence including the physicochemical properties， signal peptide， trans-membrane domain structure and the secondary structure were made. The results showed that there were differences in physicochemical properties， secondary structure，subcellular locatization between chCap1，chCap2 and Srv2. It will provide theoretical basis for developing new drug targets to control pathogen cell division and gene mapping of AC gene.

Key words：Colletotrichum higginsanum;adenylate cyclase;physicochemical properties;subcellular localization;secondary structure

希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsanum Sacc.）可以侵染菜心、小油菜、大白菜、蘿卜、結(jié)球甘藍(lán)、羽衣甘藍(lán)等十字花科蔬菜植物而引起炭疽病，是一類重要的世界性植物真菌病害[1-3]。目前，由該菌侵染菜心引起的炭疽病是菜心最常見的嚴(yán)重病害之一[4]。該病對(duì)廣東菜心種植地區(qū)產(chǎn)生重大影響，不僅降低了菜心產(chǎn)量，也影響著菜心品質(zhì)[5，6]。生產(chǎn)上對(duì)炭疽病的防治多采用多菌靈、甲基托布津、苯菌靈等苯并咪唑類化學(xué)藥劑，而由于該類藥劑作用靶標(biāo)以及作用時(shí)間的特殊性容易引起炭疽菌產(chǎn)生抗藥性，嚴(yán)重地制約著上述藥劑的進(jìn)一步使用。同時(shí)，與禾谷炭疽菌同屬炭疽菌屬的膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）對(duì)多菌靈的抗藥性受到廣泛關(guān)注[7-12]，而生產(chǎn)上尚未有新的有效藥劑用于炭疽病的防治。

植物與病原菌互作過程中，許多細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑共同作用從而完成對(duì)外界環(huán)境刺激、內(nèi)部信號(hào)傳遞以及應(yīng)對(duì)反應(yīng)處置等。其中，尤以將外界信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)部的G蛋白（鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白，Guanine nucleotide binding protein）信號(hào)途徑所發(fā)揮的作用最大。腺苷酸環(huán)化酶（Adenylate cyclase， AC）作為G蛋白信號(hào)通路調(diào)節(jié)的重要因子發(fā)揮重要作用，其功能主要是將cAMP轉(zhuǎn)化為5-AMP，從而完成信號(hào)的終止過程。通過對(duì)該酶功能的深入解析，有助于為今后開發(fā)以此為藥劑靶標(biāo)的化學(xué)農(nóng)藥提供重要的理論指導(dǎo)。目前，對(duì)于希金斯炭疽菌的AC研究卻鮮有報(bào)道，前期通過對(duì)釀酒酵母（S. cerevisiae）S288c含有的1個(gè)典型AC（Srv2）氨基酸序列，利用炭疽菌屬蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)及關(guān)鍵詞搜索[13];同時(shí)，通過SMART保守結(jié)構(gòu)域分、理化性質(zhì)、細(xì)胞信號(hào)肽、跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)以及二級(jí)結(jié)構(gòu)等生物信息學(xué)分析，明確與Srv2同源的希金斯炭疽菌AC相關(guān)蛋白ChCap1、ChCap2分別位于AC的C端和N端。

本研究基于前期研究，通過保守結(jié)構(gòu)域分析、疏水性分析、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、信號(hào)肽分析以及跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)分析、亞細(xì)胞定位等生物信息學(xué)分析，以期明確該菌AC理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征以及定位情況，同時(shí)，對(duì)其進(jìn)行同源序列之前的遺傳關(guān)系分析，以期為進(jìn)一步開展同屬于炭疽菌屬但其基因組序列尚未公布的其他炭疽菌研究提供重要的理論指導(dǎo)。endprint

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

根據(jù)前期遺傳關(guān)系分析，禾谷炭疽菌與希金斯炭疽菌在AC同源序列方面存在較近的關(guān)系，由于ChCap1、ChCap2分別位于AC的C端和N端，對(duì)上述合并序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位以及二級(jí)結(jié)構(gòu)特性與Srv2有較大的差異，因此選擇禾谷炭疽菌的AC序列中的中間序列作為希金斯炭疽菌的中間序列，從而開展后續(xù)生物信息學(xué)分析（表1）。

1.2 ?生物信息學(xué)分析

1.2.1 ?保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè) ?利用SMART網(wǎng)站（http：//smart.embl-heidelberg.de/）在線分析希金斯炭疽菌中AC蛋白序列所具有的保守結(jié)構(gòu)域特征。

1.2.2 ?蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測(cè) ?利用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.expasy.ch/tools/protparam.html）在線進(jìn)行分析預(yù)測(cè)AC相關(guān)蛋白序列的等電點(diǎn)、分子質(zhì)量及氨基酸組成等特征。

1.2.3 ?蛋白質(zhì)疏水性預(yù)測(cè) ?利用Protscale程序（http：//web.expasy.org/protscale/）對(duì)希金斯炭疽菌中AC相關(guān)蛋白序列進(jìn)行疏水性測(cè)定。

1.2.4 ?蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)肽及信號(hào)肽預(yù)測(cè) ?對(duì)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)肽（transit peptide）的預(yù)測(cè)利用TargetP 1.1 Server在線分析實(shí)現(xiàn)（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）[14]。氨基酸信號(hào)肽（Signal peptide）的預(yù)測(cè)則是利用SignalP 3.0 Server[15]在線分析實(shí)現(xiàn)（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）。在線預(yù)測(cè)信號(hào)肽使用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法（Neural networks， NN）和隱馬可夫模型（Hidden markov models， HMM）進(jìn)行操作，而根據(jù)算法不同得出的結(jié)果有所差別。

1.2.5 ?蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)及跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) ?對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)采用PHD[16]在線分析實(shí)現(xiàn)（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）。同時(shí)，對(duì)希金斯炭疽菌中AC相關(guān)蛋白序列的跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，利用TMHMM Server v. 2.0實(shí)現(xiàn)（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）[15]。

1.2.6 ?亞細(xì)胞定位分析 ?對(duì)希金斯炭疽菌中AC相關(guān)蛋白序列進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，利用ProtComp v9.0（http：//linux1.softberry.com/berry.phtml？topic=protcompan&group=programs&subgroup=proloc）實(shí)現(xiàn)[17]，以期獲得蛋白質(zhì)的定位情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 ?保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果

基于SMART分析網(wǎng)站，對(duì)ChCap1、ChCap2合并序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析。結(jié)果表明，Srv2在C端含有兩個(gè)相同的CARP保守結(jié)構(gòu)域，合并序列也含有兩個(gè)CARP保守結(jié)構(gòu)域，將其初步命名為腺苷酸環(huán)化酶蛋白（Adenylate cyclase protein），ChSrv2（圖1）。

2.2 ?ChSrv2與Srv2氨基酸組成分析結(jié)果

根據(jù)組成蛋白質(zhì)的氨基酸殘基的理化性質(zhì)，將其分為酸性氨基酸、堿性氨基酸、非極性R基氨基酸、不帶電荷的極性R基氨基酸等四大類。對(duì)ChSrv2與Srv2中氨基酸殘基組成進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果表明，ChSrv2與Srv2的氨基酸數(shù)量以及所占比例、所含最高（最低）比例氨基酸及其所占比例方面均具有較大的一致性（表2）。Srv2所含最高比例的氨基酸為絲氨酸（Ser），比例為11.00%，而ChSrv2含最高比例的氨基酸也為Ser，比例為9.60%;在所含最低比例的氨基酸方面，Srv2為半胱氨酸（Cys），比例為0.80%，ChSrv2也為Cys，最低比例為0.40%（表2）。

2.3 ?Srv2與ChSrv2理化性質(zhì)分析結(jié)果

Srv2與ChSrv2在氨基酸數(shù)量、相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)、負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)、正電荷氨基酸殘基數(shù)、分子式以及原子數(shù)量、脂肪族氨基酸指數(shù)、總平均親水性等方面均存在著較大的一致性，特別是在理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)，ChCap2與Srv2相似，理論等電點(diǎn)屬于酸性范圍內(nèi)，不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，屬于不穩(wěn)定蛋白;ChCap1與Srv2則具有較大的差異，其理論等電點(diǎn)屬于偏堿性范圍，其不穩(wěn)定系數(shù)小于40，為穩(wěn)定蛋白（表3）。

2.4 ?轉(zhuǎn)運(yùn)肽和信號(hào)肽特征

轉(zhuǎn)運(yùn)肽是一種由12～60個(gè)氨基酸殘基所組成的前導(dǎo)序列，其功能為引導(dǎo)那些在細(xì)胞溶質(zhì)中合成的蛋白質(zhì)進(jìn)入線粒體和葉綠體等細(xì)胞器。除了細(xì)胞信號(hào)蛋白外各種內(nèi)在蛋白均利用導(dǎo)肽到達(dá)細(xì)胞器。通過分析，Srv2與ChCap1、ChCap2均定位于分泌途徑上，其預(yù)測(cè)值分別為0.883、0.701、0.660，所處的概率有所不同（表4）。就信號(hào)肽預(yù)測(cè)而言，無論是根據(jù)NN進(jìn)行計(jì)算，還是根據(jù)HMM進(jìn)行計(jì)算，Srv2與ChCap1、ChCap2均不含有信號(hào)肽。

2.5 ?蛋白疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果

根據(jù)Protscale分析可知，ChCap1位于36位的絲氨酸（S），其親水性最強(qiáng)，為-1.926，而位于129位的脯氨酸（P），其疏水性最強(qiáng)（親水性最弱，下同），為1.626;ChCap2位于54位的蘇氨酸（T），其親水性最強(qiáng)，為-1.005，而位于174位的丙氨酸（A），其疏水性最強(qiáng)，為1.626。Srv2在親水性（疏水性）最強(qiáng)的氨基酸及其所在位置方面均存在著較大的不同（圖2）。endprint

對(duì)Srv2與ChCap1、ChCap2的疏水性、親水性數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明，3種蛋白在親水性最強(qiáng)氨基酸殘基位置、數(shù)值，疏水性最強(qiáng)氨基酸殘基位置、數(shù)值，疏水性氨基酸殘基數(shù)值總和以及親水性氨基酸殘基數(shù)值總和等方面均存在著較大差異，惟一的相同點(diǎn)是均為親水性蛋白，這與通過GRAVY計(jì)算所得結(jié)果一致。

2.6 ?亞細(xì)胞定位特征

通過分析表明，希金斯炭疽菌ChSrv2亞細(xì)胞定位與Srv2相同，均定位于質(zhì)膜上，這與前人對(duì)腺苷酸環(huán)化酶定位于細(xì)胞膜上的研究相一致。

2.7 ?Srv2在二級(jí)結(jié)構(gòu)特征方面與ChCap1、ChCap2存在較大差異

通過分析表明，與Srv2相同，ChCap1、ChCap2均沒有典型的跨膜結(jié)構(gòu)。對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析表明，在二級(jí)結(jié)構(gòu)組成方面，ChCap1、ChCap2與Srv2存在著較大差異（圖3）。

3 ?小結(jié)與討論

作為炭疽菌屬中重要的病原菌，希金斯炭疽菌主要危害十字花科蔬菜，造成重要的經(jīng)濟(jì)損失，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其開展了全面而深入的研究。然而，生產(chǎn)上對(duì)其引起的炭疽病多采用苯并咪唑類化學(xué)藥劑防治，而由于該藥劑作用靶標(biāo)以及作用時(shí)間的特殊性，均容易引起炭疽菌抗藥性出現(xiàn)，嚴(yán)重地制約著上述藥劑的進(jìn)一步使用，急需開發(fā)用于防治炭疽病的新作用機(jī)制化學(xué)藥劑，從而較好地挽回生產(chǎn)上的經(jīng)濟(jì)損失。

近年來，關(guān)于AC在酵母[18]、稻瘟菌[19]、大豆疫霉[20]等真核生物中的功能研究已積累了較多的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，而對(duì)于危害禾本科植物造成嚴(yán)重?fù)p失的禾谷炭疽菌的AC研究卻鮮有報(bào)道，隨著該病菌全基因組序列的公布，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其開展致病基因、抗藥性基因的研究將日趨深入。本研究基于釀酒酵母中已經(jīng)報(bào)道的Srv2，利用Blast比對(duì)、關(guān)鍵詞搜索以及通過SMART保守結(jié)構(gòu)域分析、細(xì)胞信號(hào)肽、跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)以及二級(jí)結(jié)構(gòu)等生物信息學(xué)分析，明確該菌中ChCap1、ChCap2與Srv2在理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位方面均具有較大的差異性，同時(shí)，通過對(duì)上述兩個(gè)腺苷酸環(huán)化酶相關(guān)蛋白與其他物種中的同源序列進(jìn)行Blast比對(duì)分析，明確ChCap1、ChCap2分別是希金斯炭疽菌腺苷酸環(huán)化酶蛋白序列的重要組成部分，其分別位于N端和C端。通過對(duì)其進(jìn)行序列合并，并結(jié)合其SMART保守結(jié)構(gòu)域分析、理化性質(zhì)、細(xì)胞信號(hào)肽、跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)以及二級(jí)結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位等生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明合并后的序列在上述特征、性質(zhì)方面與Srv2具有較大的相似性。該研究為進(jìn)一步解析希金斯炭疽菌腺苷酸環(huán)化酶的序列以及功能研究提供重要的理論指導(dǎo)。

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