趙 利，陳桂信*，潘東明*，王玉珍，呂恃衡，姜翠翠

(1.福建農(nóng)林大學 園藝學院，福建 福州 350002;2.福建農(nóng)林大學 園藝產(chǎn)品貯運保鮮研究所，福建 福州 350002;3.福建省農(nóng)業(yè)科學院 果樹研究所，福建 福州 350013)

乙醇酸氧化酶是植物光呼吸代謝的一種關鍵酶，催化羥乙酸鹽氧化成乙醛酸鹽同時生成等分子量的H2O2［1］。有報道［2］表明過氧化氫參與信號傳導和具有誘導抗逆性，它的快速積累是非病原性信號早期超敏反應的一個特點。GLO 可能與植物的抗病性有關，通過轉基因過量表達GLO 基因，可以增強植物的廣譜抗病性［4］。從菠菜中分離到GLO 基因，通過農(nóng)桿菌介導法導入蘋果，獲得了2 個轉GLO 基因的抗性芽［4］，水稻［5］等植物上面均有研究。利用蛋白質表達譜比較抗性和易感性的體細胞雜交，表明GLO 在抗病植物中含量豐富，在歐洲油菜和擬南芥之間的體細胞雜交種產(chǎn)生了對黑脛病的顯著抗性［6］。同時，在大麥［7］、甜瓜［3］中與致病性真菌接種，其GLO 酶活性增強。此外，GLO 在植物的應激反應中有重要的作用。GLO 酶的活性在各種環(huán)境脅迫中的誘導已被證實，如干旱脅迫已在豇豆、豌豆和煙草中得到證實［8-10］。GLO 在植物受到病原微生物侵染后引發(fā)的一系列防御反應中起著非常重要的作用，顯示出在基因工程抗性育種研究中的廣闊應用前景。研究表明，近幾年來在玉米［11］、水稻［12］、春蘭［13］等植物上克隆出了GLO 基因。GLO 為多基因家族，水稻中發(fā)現(xiàn)了5 個GLO 基因［14］，但是在果樹上，尤其是薔薇科李屬，僅碧桃上克隆到部分GLO 基因序列，其它樹種未見報道。

?(Prunus salicina Lindl.var.cordata J.Y.Zhang et al.)為薔薇科李屬，桃形李實，是福建省名、特、優(yōu)的核果類果樹，生產(chǎn)上?常遭受流膠病、細菌性穿孔病、白粉病、縮葉病等病害［15］的侵襲和危害，嚴重影響樹勢、產(chǎn)量和果實品質，甚至縮短樹體的生產(chǎn)壽命。本研究在已構建好的?葉片cDNA 文庫基礎上，利用96 孔板法從?葉片cDNA 文庫中分離獲得一個GLO 全長基因，對該基因進行了生物信息學分析及在?葉片5 個不同生長發(fā)育時期的表達模式分析，為進一步分析該基因在?的抗逆性和病蟲害的防御過程中提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 植物材料與試劑

? 葉芽(2012 年2 月)、展開葉(2012 年3 月初)、幼葉(2012 年4 月中旬)、成熟葉(2012 年5 月中旬)、老葉(2012 年8 月中旬)采自福建寧德周寧?果園。將上述樣品迅速凍存于液氮中，放于-80 ℃。

PrimerScriptTMRT reagent Kit、2×SYBR Premix ExTaqTM、試驗所用的各種工具酶、dNTP 購自大連寶生物公司;大提質粒試劑盒購自Qiagen 公司;引物合成與測序委托上海鉑尚生物技術公司完成。

1.2 cDNA 文庫的構建

本研究以?(Prunus salicina Lindl.var.cordata J.Y.Zhang et al.)5 個不同生長發(fā)育時期葉片為材料提取總RNA，然后將這些總RNA 按相同比例混合，采用鄭鴻昌［16］的方法構建?均一化全長cDNA文庫，其該文庫是以pBluescriptⅡKS(+)為載體，原始文庫的滴度為2.0×108pfu/mL，其重組率為98%，插入片段大小為1 800 bp 左右，文庫質量良好。

1.3 ?葉片GLO 基因的分離與序列分析

根據(jù)NCBI 上不同物種的GLO 序列，利用DNAMAN 軟件設計簡并引物，委托鉑尚生物技術(上海)有限公司合成。GLOF:5'-GGTKTATGACTACTATGCWTCTGGTGC-3';GLOR:5'-GCATCCTCWGCTGTAAKHACACCCTT-3'。用通用引物驗證篩選片段大小，M13R:5'-GGAAACAGCTATGACCATG-3'，M13F:5'-GTAAAACGACGCCAGT-3'。采用基于PCR 技術的96 孔板法進行cDNA 文庫的篩選［17］，PCR 反應程序為:95 ℃5 min，95 ℃12 s，58 ℃30 s，72 ℃53 s，共35 個循環(huán)，72 ℃10 min，4 ℃pause。根據(jù)目標克隆在文庫中的豐度取適量稀釋度的文庫用DH10B 菌株鋪于96 板，建立一級庫，每孔大約有40 個克隆，放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～10 h，利用PCR 反應，進行陽性克隆的篩選，將篩到的陽性孔再次進行克隆的稀釋，建立二級庫，每孔大約有6 個陽性克隆，操作步驟同上。將二級庫中篩到的陽性克隆鋪于含有AMP 抗性的LB 平板上培養(yǎng)過夜，挑單克隆進行PCR 鑒定，以確定陽性單克隆。

將得到的陽性克隆送至鉑尚生物技術(上海)有限公司測序，利用DNAMAN 軟件以及http://www.ncbi.nlm.nih.gov/等網(wǎng)站提供的各類生物信息學軟件對序列進行在線分析。利用ProtParam 程序(http://web.expasy.org/protparam/)預測蛋白質的分子量和等電點;利用MEGA5.2 做進化樹分析。

1.4 ?葉片GLO 基因在?不同生長發(fā)育時期的表達分析

參照TaKaRa 公司PrimerScriptTMRT reagent Kit 逆轉錄成cDNA，將反轉錄的單鏈cDNA 稀釋10 倍，取1 μL 作為模板，以?tubuin 基因作為內參基因，參照2×SYBR Premix ExTaqTM(TaKaRa，大連)熒光定量試劑盒說明書進行熒光定量試驗。內參基因引物為Nai-tubuinF:5'-TCGGATGATGATGACCTTCTCTGTG-3';Nai-tubuinR:5'-CATACACTCGTCTGCGTTCTCCA-3'。目的基因引物分別是上游:5'-TGAGGCTGGTGTAAGGAA-3'，下游:5'-GCGAACGACATCCACTTA-3'。

2 結果與分析

2.1 ?葉片GLO 基因的分離與序列分析

參考其他植物GLO 基因的保守序列設計簡并引物，建立二級庫，經(jīng)2 輪96 孔板篩選以及DH10B菌株平板上單克隆的鑒定，獲得GLO 基因cDNA 陽性單克隆(圖1，A)。用通用引物M13F 和M13R 對上述的單克隆進行PCR 驗證，獲得其片段大小為1 500 bp 左右(圖1，B)。測序結果(圖2)表明:該陽性克隆為1 531 bp，開放閱讀框為1 122 bp，編碼374 個氨基酸，包括一個起始密碼子(ATG)和一個終止密碼子(TAA)。GLO 的分子量為126 024.8;理論等電點為5.0;不穩(wěn)定指數(shù)為40.95，為不穩(wěn)定蛋白。脂肪系數(shù)為26.52;其疏水性平均值(GRAVY)為0.688;分子為C4626H7723N1531O1956S310，總原子數(shù)為16 146，該基因命名為PsGLO。

圖1 ?PsGLO 不同引物擴增片段電泳檢測結果Fig.1 Detection by agarose electrophoresis of PsGLO amplified from the Prunus salicina with different primers

2.2 PsGLO 基因編碼的氨基酸序列同源性比對及其進化分析

在NCBI 上進行PsGLO 蛋白比對，該蛋白與其他植物的GLO 蛋白具有很高的保守性，編碼的蛋白屬于輔基FMN-α 羥基酸氧化酶的同源家族蛋白，此蛋白家族主要存在于原核生物和真核生物中，這個家族的成員主要包括黃色蛋白(FCB2)、乙醇酸氧化酶(GLO)、乳酸單氧酶(LMO)、扁桃酸脫氫酶(MDH)和長鏈羥基酸氧化酶(CHAO)，其中，乙醇酸氧化酶(GLO)存在于綠色植物中，是光呼吸過程中的關鍵酶之一。乙醇酸氧化酶(GLO)是輔基FMN-α 羥基酸氧化酶的同源家族蛋白之一，近幾年來國內外一些研究表明，F(xiàn)MN 誘導植物抗病能力增強與H2O2積累，苯基丙酸類合成途徑的激活以及酚類物質的積累是密切相關的［18］，由此，可知乙醇酸氧化酶(GLO)也參與其中。利用MEGA5.2 軟件最大似然法，將PsGLO 預測蛋白與GenBank 上登錄的不同物種的GLO 進行系統(tǒng)進化樹分析，圖3 結果表明，PsGLO 與陸地棉Gossypium hirsutum(AEX09184.1)、大豆Glycine max(NP_001238412.1)、菜豆Phaseolus vulgaris(AGV54360.1)的親緣關系相對較近，陸地棉、大豆、菜豆都屬于草本雙子葉植物，在木本植物中沒有克隆該基因。

圖2 PsGLO 基因cDNA 全長核苷酸序列和推測氨基酸序列Fig.2 Nucleotide sequence of PsGLO Cdna and deduced amino acid sequence

圖3 ?PsGLO 蛋白與其他物種GLO 蛋白進化樹分析Fig.3 Phylogenetic analysis of PsGLO from the Prunus salicina and other plants

2.3 PsGLO 基因在?葉片不同生長發(fā)育時期的表達模式分析

利用實時熒光定量PCR 技術分析PsGLO基因?葉片不同生長發(fā)育時期的表達模式，圖4 結果表明，PsGLO 基因在葉片不同生長發(fā)育都有表達，其中在老葉中表達量最高，葉芽中表達量最低，在植物辣椒上最早在1989 年開始研究植物的“年齡相關的抗性”(age-related resistance，ARR)［19］，植物上人們把當年老的植株或葉片表現(xiàn)出來的對病害增強或降低的抗性通常就被叫為年齡相關的抗性［20］，由此，可以推測PsGLO 基因?葉片葉生長發(fā)育過程對病害的抗性起著一定的作用，在老葉中PsGLO 的表達量相對其它4 個時期高。

圖4 PsGLO 基因在?葉片不同生長時期的表達分析Fig.4 Expression of PsGLO gene during leaf of different stages in the Prunus salicina

3 結論與討論

近幾年來國內外研究結果表明，光呼吸是植物長期進化過程中，為了適應環(huán)境變化，提高抗逆性而形成光呼吸途徑［1］，乙醇酸氧化酶(GLO)是光呼吸過程中的關鍵酶，在植物受到病原微生物的侵染后引發(fā)一系列的防御反應中起著非常重要的作用，顯示出其在基因工程抗性育種研究中的廣闊應用前景。研究表明，在輻照光下，轉基因煙草的乙醇酸氧化酶活性降低到閾值一下，可以提高其光抑制作用，增加植物的抗性［21］。在國內，將在菠菜中獲得的GLO 基因，通過根癌農(nóng)桿菌介導將GLO 基因導入蘋果，獲得兩個抗性芽［4］。

本實驗從構建的?葉片5 個不同時期的RNA，然后將這些總RNA 按相同比例混合，采用鄭鴻昌［16］的方法構建?均一化全長cDNA 文庫，首次成功分離了木本植物中的乙醇酸氧化酶(GLO)基因的全長序列，填補了木本植物中GLO 基因克隆研究的空白。雖然其確切的生物學功能還有待于進一步的試驗驗證，但是該基因全長序列的獲得為深入認識其生物學功能和了解乙醇酸合成成途徑奠定了基礎。通過已得到的PsGLO 基因序列，在NCBI 上進行氨基酸序列比對，利用MEGA5.2 構建進化樹，得到該基因與草本雙子葉植物陸地棉親緣關系較近。因為在木本植物中，沒有人對其進行研究，未發(fā)現(xiàn)木本植物中的乙醇酸氧化酶(GLO)的氨基酸序列［22］。本試驗中實時熒光定量PCR 結果顯示，在?的葉片中5 個不同生長發(fā)育階段都有表達，其中，在老葉中表達量最高。根據(jù)”年齡相關的抗性”(age-related resistance，ARR)的理論基礎，前人在不同的植物-病原體系中對植物年齡與病害抗性(age-related resistance，ARR)的研究由來已久［23-27］。研究表明，隨著植物年齡的增長，對有些病害表現(xiàn)的更敏感，如在水稻種，老葉片對Xanthomonas campestris pv Oryzae 以及Pyricularia oryzae 的抗性比年輕葉片抗性強。類似的，成年煙草對Peronospora tobacina 的抗性比年輕的植株要強。有熒光定量的結果可知，乙醇酸氧化酶(GLO)在葉片不斷生長發(fā)育過程中有葉芽到展開葉不斷增加，在幼葉中相對前面兩個時期也少一些，成熟葉和老葉相對于前面的3 個時期要高，但是，老葉中最高。由此，可以推測在生長過程中老葉對病害的抗性要比年輕的葉片抗性要強。

［1］Foyer C H，Bloom A J，Queval G，et al.Photorespiratory metabolism:genes，mutants，energetics，and redox signaling［J］.Annual Review of Plant Biology，2009，60(1):455-484.

［2］Lamb C，Dixon R A.The oxidative burst in plant disease resistance［J］.Annual Review of Plant Biology，1997，48(1):251-275.

［3］Taler D，Galperin M，Benjamin I，et al.Plant R genes that encode photorespiratory enzymes confer resistance against disease［J］.The Plant Cell Online，2004，16(1):172-184.

［4］張軍科，洪小娟，馬鋒旺.乙醇酸氧化酶基因植物表達載體構建及轉化蘋果的研究［J］.華北農(nóng)學報，2009(6):33-37.

［5］胥華偉，張改娜，侯典云.乙醇酸氧化酶基因超表達載體的構建與水稻的遺傳轉化［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學，2010(8):188-190.

［6］Bohman S，Wang M，Dixelius C.Arabidopsis thaliana-derived resistance against Leptosphaeria maculans in a Brassica napus genomic background［J］.Theoretical and Applied Genetics，2002，105(4):498-504.

［7］Sch?fer P，Hückelhoven R，Kogel K-H.The white barley mutant albostrians shows a supersusceptible but symptomless interaction phenotype with the hemibiotrophic fungus Bipolaris sorokiniana［J］.Molecular Plant-Microbe Interactions，2004，17(4):366-373.

［8］Mittler R，Zilinskas B A.Regulation of pea cytosolic ascorbate peroxidase and other antioxidant enzymes during the progression of drought stress and following recovery from drought［J］.The Plant Journal，1994，5(3):397-405.

［9］Mukherjee S，Choudhuri M.Implications of water stress-induced changes in the levels of endogenous ascorbic acid and hydrogen peroxide in Vigna seedlings［J］.Physiologia Plantarum，1983，58(2):166-170.

［10］Rizhsky L，Liang H，Mittler R.The combined effect of drought stress and heat shock on gene expression in tobacco［J］.Plant Physiology，2002，130(3):1143-1151.

［11］Zelitch I，Schultes N P，Peterson R B，et al.High glycolate oxidase activity is required for survival of maize in normal air［J］.Plant Physiology，2009，149(1):195-204.

［12］Lu Y，Li Y，Yang Q，et al.Suppression of glycolate oxidase causes glyoxylate accumulation that inhibits photosynthesis through deactivating Rubisco in rice［J］.Physiologia Plantarum，2013，149(1):194-203.

［13］向林，李伯鈞，秦德輝.春蘭GLO 基因的克隆和實時定量表達分析［J］.浙江農(nóng)業(yè)學報，2011(3):517-522.

［14］Zhang Z，Lu Y，Zhai L，et al.Glycolate oxidase isozymes are coordinately controlled by GLO1 and GLO4 in rice［J］.PloS one，2012，7(6):639-658.

［15］黃月淑.油? 主要病蟲害的發(fā)生與防治［J］.植物醫(yī)生，2001，14(6):25-25.

［16］鄭鴻昌.夜來香均一化全長cDNA 文庫的構建與花香相關基因的遺傳轉化［D］.福州:福建農(nóng)林大學，2012.

［17］Yim Y S，Moak P，Sanchez V H，et al.A BAC pooling strategy combined with PCR-based screenings in a large，highly repetitive genome enables integration of the maize genetic and physical maps［J］.BMC Genomics，2007，8(1):47-49.

［18］Taheri P，Tarighi S.A survey on basal resistance and riboflavin-induced defense responses of sugar beet against Rhizoctonia solani［J］.Journal of Plant Physiology，2011，168(10):1114-1122.

［19］Kingkun D，Taeyangkun H，Hongsanho J.Expression of age-related resistance in pepper plants infected with Phytophthora capsici［J］.Plant Disease，1989:745-750.

［20］鄧本良.核黃素及核黃素結合蛋白對擬南芥抗病抗逆調控作用的初步研究［D］.南京:南京農(nóng)業(yè)大學，2012.

［21］Chern M，Bai W，Chen X，et al.Reduced expression of glycolate oxidase leads to enhanced disease resistance in rice［J］.Peer J，2013，10(2):28-32.

［22］鄔萌萌，譚曉風，周榮，等.油茶EMF2 基因的全長cDNA 克隆及序列分析［D］.經(jīng)濟林研究，2013，31(2):7-12.

［23］Barna B，Gy?rgyi B.Resistance of young versus old tobacco leaves to necrotrophs，fusaric acid，cell wall-degrading enzymes and autolysis of membrane lipids［J］.Physiological and Molecular Plant Pathology，1992，40(4):247-257.

［24］Kus J V，Zaton K，Sarkar R，et al.Age-related resistance in Arabidopsis is a developmentally regulated defense response to Pseudomonas syringae［J］.The Plant Cell Online，2002，14(2):479-490.

［25］Mutty S，Hossenkhan N T.Age-related resistance in commercial varieties of solanum tuberosum to the late blight pathogen，phytophthora infestans［J］.Plant Pathology Journal，2008，7(2):168-173.

［26］Rusterucci C，Zhao Z，Haines K，et al.Age-related resistance to Pseudomonas syringae pv.tomato is associated with the transition to flowering in Arabidopsis and is effective against Peronospora parasitica［J］.Physiological and Molecular Plant Pathology，2005，66(6):222-231.

［27］Zeier J.Age-dependent variations of local and systemic defence responses in Arabidopsis leaves towards an avirulent strain of Pseudomonas syringae［J］.Physiological and Molecular Plant Pathology，2005，66(1):30-39.