李 誠，王 祿，蔣軍喜*，王園秀，趙尚高，李幫明，余 強(qiáng)，涂貴慶

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，江西 南昌 330045;2.江西省奉新縣農(nóng)業(yè)局，江西 奉新 330700)

獼猴桃(Actinidia spp.)營養(yǎng)豐富，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，是一種深受消費(fèi)者和生產(chǎn)者喜愛的新興水果。江西省奉新縣是我國獼猴桃生產(chǎn)大縣，素有“中國獼猴桃之鄉(xiāng)”之美譽(yù)。近年來，隨著奉新獼猴桃種植規(guī)模的逐年擴(kuò)大，獼猴桃果實(shí)熟腐病發(fā)生呈明顯加重趨勢，嚴(yán)重時(shí)病果率高達(dá)80%以上，嚴(yán)重制約奉新獼猴桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，成為奉新獼猴桃生產(chǎn)上亟待解決的問題［1］。

獼猴桃果實(shí)熟腐病又稱獼猴桃黃腐病，是獼猴桃果實(shí)成熟期和采后貯藏期主要病害之一，主要由Botryosphaeria dothidea(無性態(tài)Macrophoma sp.或Fusicoccum aesculi)和Phomopsis sp.(有性態(tài)Diaporthe sp.)引起［2-5］。目前該病害已在新西蘭［6］、韓國［7］、日本［3］、意大利［8］和智利［9］等多個(gè)國家和地區(qū)報(bào)道。我國于1989 年在陜西周至縣和北京房山區(qū)的獼猴桃上首次報(bào)道該病害的發(fā)生［10］，其后該病害在我國的浙江江山［11］、福建建寧［12］和四川蒼溪［13］等地相繼報(bào)道發(fā)生。筆者于2010—2011 年對奉新獼猴桃果實(shí)熟腐病病原菌進(jìn)行鑒定后明確奉新獼猴桃果實(shí)熟腐病由6 種真菌引起，其中主要為B.dothidea(占83.0%)和Phomopsis sp.(占8.9%)［1］。鑒于目前國內(nèi)外對獼猴桃果實(shí)熟腐病研究較少的現(xiàn)狀，本文從病菌的生物學(xué)特性、寄主范圍及其品種抗性對該病害進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，旨在為深入了解該病害的發(fā)生規(guī)律和綜合防治提供理論依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 供試菌株

供試菌株分別為葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)奉新第6 號菌株(BDF-6)和擬莖點(diǎn)霉菌(Phomopsis sp.)奉新第11 號菌株(PSF-11)，兩種菌株均由作者于2012 年12 月從奉新獼猴桃果實(shí)熟腐病病果中分離獲得，并通過致病性測定被確定為強(qiáng)致病力菌株。菌株用甘油長期保存于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室4 ℃冰箱，試驗(yàn)前轉(zhuǎn)接PDA 平板進(jìn)行活化和擴(kuò)繁。

1.2 病菌生物學(xué)特性測定

1.2.1 溫度對病菌生長速率的影響 將直徑為5 mm 的適齡B.dothidea 和Phomopsis sp.菌餅移至試前備好的PDA 平板上，分別置于5，10，15，20，25，30，35 ℃7 個(gè)不同溫度梯度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每處理3 次重復(fù)，培養(yǎng)96 h 后用“十字交叉法”測量菌落直徑，計(jì)算病菌生長速率。

1.2.2 pH 對病菌生長速率的影響 用1.0 mol/L 的鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)配pH 為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 和13 共12 個(gè)不同酸堿度的PDA 平板，將直徑為5 mm 的適齡菌落邊緣菌餅接種至不同pH的PDA 平板中央，每平板接一菌餅，每處理3 次重復(fù)，接種后將其置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，96 h 后用“十字交叉法”測量菌落直徑，計(jì)算病菌生長速率。

1.2.3 不同培養(yǎng)基質(zhì)對病菌生長速率的影響 選用馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、牛肉浸膏培養(yǎng)基(NA)、燕麥片瓊脂培養(yǎng)基(OMA)、玉米粉瓊脂培養(yǎng)基(CMA)、查氏培養(yǎng)基(Czapek)、胡蘿卜培養(yǎng)基(CA)、苜蓿煎汁培養(yǎng)基(AEA，alfalfa extract agar)和煙草煎汁培養(yǎng)基(TEA，tobacco extract agar)8 種培養(yǎng)基，相關(guān)配方參照文獻(xiàn)［14］。將直徑為5 mm 的適齡菌落菌餅接種于不同培養(yǎng)基平板上，每處理3 次重復(fù)，接種后置25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，96 h 后用“十字交叉法”測量菌落直徑，計(jì)算病菌生長速率。

1.2.4 不同碳、氮源對病菌生長速率的影響 以Czapek 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以等碳量的葡萄糖、α-乳糖、可溶性淀粉、麥芽糖、甘露醇、山梨醇、纖維二糖和甜醇取代蔗糖，配制9 種不同碳源培養(yǎng)基;同理以等氮量的硝酸鉀、磷酸二氫銨、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、硝酸銨和氯化銨取代硝酸鈉，配制8 種不同氮源培養(yǎng)基。將直徑為5 mm 的適齡菌落菌餅接種于含不同碳、氮源的培養(yǎng)基平板上，每處理3 次重復(fù)，接種后置25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，96 h 后用“十字交叉法”測量菌落直徑，計(jì)算病菌生長速率。

1.3 寄主范圍及獼猴桃品種抗性鑒定

1.3.1 獼猴桃果實(shí)熟腐病菌的寄主范圍鑒定 選取葡萄科(馬奶提、紅提、無籽葡萄)、薔薇科(豐水梨、蘋果梨、嘎納蘋果、嘎啦蘋果、油桃、冰糖心蘋果和香梨)、葫蘆科(甜瓜)、蕓香科(甜桔和檸檬)和茄科(圣女果)共5 科14 種水果進(jìn)行抗性鑒定。方法如下:將健康近成熟果實(shí)的待接種部位用酒精棉球擦拭消毒，待酒精揮發(fā)后用經(jīng)消毒的鑷子輕輕刮開一直徑約5 mm 大小的小傷口，以直徑為5 mm 的B.dothidea和Phomopsis sp.菌餅為接種體，將其菌絲面緊貼果實(shí)傷口面進(jìn)行接種，設(shè)無菌PDA 基塊作為對照，接種后用無菌濕棉球進(jìn)行保濕，置于25 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每處理6 重復(fù)，逐日觀察發(fā)病情況，4 d 后測量病斑直徑，計(jì)算病斑擴(kuò)展速率，依據(jù)病斑擴(kuò)展速率來測定獼猴桃果實(shí)熟腐病菌對不同種類水果的侵染能力差異。觀測后對發(fā)病果實(shí)進(jìn)行病菌再分離。

1.3.2 不同獼猴桃品種對果實(shí)熟腐病菌的抗性 選取海沃德、金魁、徐香、秦美、紅陽、魁蜜、華優(yōu)、楚紅、云海1 號、晚紅、武植1 號、金桃、青皮紅香、金果、早鮮、金艷和美良1 號共17 個(gè)獼猴桃品種進(jìn)行品種抗性鑒定，鑒定方法同1.3.1。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析方法

采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，處理間的顯著差異分析采用Duncan’s 新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 獼猴桃果實(shí)熟腐病菌生物學(xué)特性

2.1.1 溫度對病菌生長速率的影響 不同溫度對B.dothidea 和Phomopsis sp.生長影響較大，在5～35 ℃的溫度范圍均能正常生長，但溫度低于15 ℃時(shí)生長相對緩慢，大于30 ℃時(shí)生長速率迅速降低，B.dothidea和Phomopsis sp.的最適生長溫度均為25 ℃，此時(shí)生長速率分別為26.58 mm/d 和9.14 mm/d(圖1)。

2.1.2 pH 對病菌生長速率的影響 B.dothidea 和Phomopsis sp.對酸堿度的適應(yīng)能力較強(qiáng)，只有在pH為2～3 的強(qiáng)酸性基質(zhì)中不能正常生長。在供試的其余pH 基質(zhì)中均能正常生長，但其病菌的生長速率存在較顯著差異，在中性或略偏堿的條件下最適宜生長，在中性基質(zhì)中B.dothidea和Phomopsis sp.的生長速率分別高達(dá)26.37 mm/d 和8.12 mm/d(圖2)。

圖1 溫度對病菌菌絲生長的影響Fig.1 Effect of temperature on mycelial growth of pathogenic fungi

圖2 pH 對病菌菌絲生長的影響Fig.2 Effect of pH on mycelial growth of pathogenic fungi

2.1.3 不同培養(yǎng)基質(zhì)對病菌生長速率的影響B(tài).dothidea 在PDA、CA 和苜蓿煎汁培養(yǎng)基上生長較快，生長速率分別高達(dá)27.00，27.00，26.67 mm/d，在煙葉煎汁培養(yǎng)基、OMA 和CMA 上次之，在Czapek 和NA 上生長較慢，生長速率分別為15.11 mm/d 和10.11 mm/d;Phomopsis sp.在煙葉煎汁培養(yǎng)基、PDA、CA 和苜蓿煎汁培養(yǎng)基上生長較快，生長速率分別為14.44、13.22，12.67，11.89 mm/d，在OMA、Czapek 和CMA 上次之，在NA 中生長緩慢，生長速率為5.11 mm/d(圖3)。

圖3 不同培養(yǎng)基對病菌菌絲生長的影響Fig.3 Effect of medium on mycelial growth of pathogenic fungi

2.1.4 不同碳、氮源對病菌生長速率的影響在9 種供試碳源培養(yǎng)基上，B.dothidea 和Phomopsis sp.均能正常生長，其中蔗糖、葡萄糖、麥芽糖和纖維二糖最適宜兩種病菌的生長，乳糖、淀粉、甘露醇和甜醇次之，在山梨醇中生長最慢(表1)。

在8 種供試氮源培養(yǎng)基上，B.dothidea 和Phomopsis sp.均能正常生長，但存在較顯著差異，最適生長氮源為酵母膏、牛肉膏和蛋白胨，磷酸二氫銨和硝酸鈉次之，在氯化銨、硝酸銨和硝酸鉀中生長最慢(表1)。

表1 不同碳氮源對病菌菌絲生長的影響Tab.1 Effect of different carbon(nitrogen)sources on mycelia growth of pathogenic fungi

圖4 病菌對不同種類水果的侵染能力Fig.4 Pathogenicity of pathogenic fungi on different fruit species

圖5 病菌對不同獼猴桃品種的侵染能力Fig.5 Pathogenicity of pathogenic fungi on different varieties of kiwifruit

2.2 寄主范圍及獼猴桃品種抗性鑒定

2.2.1 獼猴桃果實(shí)熟腐病菌的寄主范圍鑒定 人工傷口接種試驗(yàn)表明，B.dothidea 和Phomopsis sp.能侵染馬奶提、紅提、無籽葡萄、豐水梨、蘋果梨、香梨、冰糖心蘋果、嘎納蘋果、嘎啦蘋果、油桃、梨瓜、甜桔、檸檬和圣女果等共5 科14 種水果(圖4)，對發(fā)病果實(shí)進(jìn)行病菌再分離，分離到與接種菌一致的病菌。

2.2.2 不同獼猴桃品種對果實(shí)熟腐病菌的抗性 17 個(gè)獼猴桃品種分別被刺傷接種B.dothidea 和Phomopsis sp.，96 h 后，除海沃德、云海1 號和金艷3 個(gè)品種無發(fā)病癥狀外，其余14 個(gè)品種均表現(xiàn)出不同程度的感病癥狀(圖5)，其中秦美最感病，被B.dothidea 和Phomopsis sp.侵染后，病斑擴(kuò)展速率分別達(dá)8.70 mm/d和6.67 mm/d;晚紅感病性相對最低，被B.dothidea 和Phomopsis sp.侵染后，病斑擴(kuò)展速率僅為2.92 mm/d 和2.31 mm/d;其他12 個(gè)品種的感病性則介于其間。對發(fā)病獼猴桃進(jìn)行病菌再分離，得到與接種菌一致的病菌。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)對獼猴桃果實(shí)熟腐病菌的生物學(xué)特性及寄主抗病性進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，結(jié)果表明不同溫度、pH、培養(yǎng)基和碳氮源對病菌菌絲生長存在較顯著差異，菌絲生長的最適溫度為25 ℃，最適pH 為7，最適培養(yǎng)基為PDA、CA 和苜蓿煎汁培養(yǎng)基，最有利于菌絲生長的碳源為蔗糖、葡萄糖、麥芽糖和纖維二糖，最佳氮源為酵母膏、牛肉膏和蛋白胨。研究還發(fā)現(xiàn)獼猴桃熟腐病菌能侵染供試的全部5 科14 種植物，表明其寄主范圍較廣。試驗(yàn)中篩選到海沃德、云海1 號和金艷3 個(gè)高抗果實(shí)熟腐病的獼猴桃品種，這3 個(gè)高抗品種除可供生產(chǎn)中直接利用外，還可以作為抗病育種和抗病機(jī)理研究的寶貴材料。

有關(guān)其他寄主植物上的葡萄座腔菌和擬莖點(diǎn)霉菌的生物學(xué)特性研究有見報(bào)道，但之前尚未見過對獼猴桃上的葡萄座腔菌和擬莖點(diǎn)霉菌的生物學(xué)特性研究。趙曉軍［15-16］等記述棗樹干腐病菌(B.dothidea)在PDA 上生長較好，在Czapek 中生長最差，最適溫度為31 ℃，最適pH 為6，蔗糖和硝酸鉀為最佳碳氮源，與本研究結(jié)果相比存在一定差異;劉琪［17］、張勇［18］和李紅葉［19］等記述李樹、扁桃和梅樹流膠病菌(B.dothidea)的最適生長溫度為25-30 ℃，最佳氮源為蛋白胨，與本研究結(jié)果較相吻合。有關(guān)Phomopsis sp.，牛曉慶等［20］記述油棕葉斑病菌(Phomopsis sp.)最適培養(yǎng)基為PDA，最適溫度25 ℃，最適pH 為7，以葡萄糖和蛋白胨為最佳碳氮源，與本研究結(jié)果較相吻合;姜淑霞等［21］記述板栗褐緣葉枯病菌(Phomopsis sp.)最適溫度為20～30 ℃，最適pH 為5～6，最佳碳氮源分別為葡萄糖和氯化銨，梁臣等［22］記述樺樹枯枝病菌(Phomopsis sp.)在20～30 ℃，偏酸性條件下生長較好，蔗糖為最佳碳源，蛋白胨為最佳氮源，與本研究結(jié)果存在一定差異。不同寄主來源的葡萄座腔菌和擬莖點(diǎn)霉菌其生物學(xué)特性不完全相同，提示在對這些病菌進(jìn)行人工培育時(shí)，需要設(shè)置不同的培養(yǎng)條件。

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