劉中華，余 華，方樹民，許泳清，邱永祥，蔡南通

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物研究所，福建 福州 350013;2.農(nóng)業(yè)部南方薯類觀測實(shí)驗(yàn)站，福建 福州 350013;3.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 中心實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350012;4.福建農(nóng)林大學(xué)，福建 福州 350003)

甘薯瘟是一種細(xì)菌性(Ralstonia solanacearum)根莖維管束病害，是由青枯假單孢菌(Pseudomonas solanacearum Smith)引起的一種病害。不同寄主的青枯假單孢菌具有不同的致病性，同一寄主也存在著不同的致病型［1］，甘薯瘟的發(fā)生是青枯假單胞菌中多種致病因子共同作用的結(jié)果［2］。甘薯瘟病在我國南方薯區(qū)發(fā)生廣，為害重，一般發(fā)病輕者減產(chǎn)20%～30%，重者達(dá)70%～80%，個(gè)別田塊甚至絕收，給甘薯生產(chǎn)造成很大的危害［3-4］，為國內(nèi)植物檢疫對象，于1946 年在我國廣東、廣西首次發(fā)現(xiàn)，1958 年傳入湖南和江西，1963 年傳到浙江省平陽縣，1971 年傳入福建省福鼎市［5］。積極推廣和換栽抗病品種，是防治薯瘟病最經(jīng)濟(jì)有效的措施［6］。在篩選抗病品種方面主要有人工接種鑒定和病圃自然鑒定兩種方式。田間鑒定可以確保品種抗病性更接近生產(chǎn)實(shí)際，有直接指導(dǎo)作用，如可與人工接種相結(jié)合則品種抗性鑒定結(jié)果更加可靠。病圃應(yīng)設(shè)置在甘薯生態(tài)區(qū)薯瘟病常發(fā)、重發(fā)區(qū)，并種植適合的感病誘發(fā)品種群［7］。2008 年起福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所在福鼎市疊石鄉(xiāng)大洋村建立了甘薯瘟田間自然鑒定圃，2009 年該病圃入選國家甘薯產(chǎn)業(yè)體系“薯瘟病綜合防治試驗(yàn)示范基地”，病圃病原菌菌群分布和變化情況直接影響鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，項(xiàng)目組對2010—2012 年間連續(xù)3 年的鑒定結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析和比較，并且于2012 年利用系統(tǒng)聚類的方法對3 個(gè)對照品種在病圃不同地塊的發(fā)病情況進(jìn)行聚類，以期對病圃地塊的致病力差異進(jìn)行歸類，對今后的鑒定工作的更好開展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

福建省福鼎市疊石鄉(xiāng)大洋村國家現(xiàn)代甘薯產(chǎn)業(yè)體系“薯瘟病綜合防治試驗(yàn)示范基地”，該病區(qū)甘薯瘟發(fā)病始于20 世紀(jì)70 年代后期，病區(qū)面積1.33 hm2，連年發(fā)病較重，已經(jīng)作為國家甘薯產(chǎn)業(yè)體系“甘薯瘟田間誘發(fā)自然鑒定圃”開展甘薯品種(系)的抗瘟鑒定工作。

1.2 試驗(yàn)時(shí)間

2010—2012 年在甘薯種植季節(jié)進(jìn)行抗瘟鑒定工作，系統(tǒng)聚類研究的試驗(yàn)安排在2012 年7—11 月。

1.3 試驗(yàn)材料

本研究所用甘薯對照品種均來自本中心甘薯資源圃，其中:新種花(CK1):高感甘薯瘟Ⅰ、Ⅱ型菌;金山57(CK2):高抗甘薯瘟Ⅰ型菌、感Ⅱ型菌;湘薯75-55(CK3):高抗甘薯瘟Ⅰ型菌、中抗Ⅱ型菌、感潛伏侵染型薯瘟菌;其它抗瘟鑒定材料來自國內(nèi)外育種單位。

1.4 系統(tǒng)聚類分析研究試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取病圃內(nèi)長24 m、寬10 m 的地塊開展研究，每3 個(gè)鑒定品種后1 次放置新種花、金山57、湘薯75-55 3 個(gè)對照品種，鑒定品種和對照品種每小區(qū)種植10 株，每個(gè)對照品種共放置23 個(gè)小區(qū)，株距15 cm，行距1.1 m。在甘薯收獲季節(jié)進(jìn)行挖根調(diào)查，對對照品中國逐株鑒定，按照每株的發(fā)病級(jí)別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，最后根據(jù)不同級(jí)別的株數(shù)、總株數(shù)、發(fā)病率、病情指數(shù)等數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)聚類，以研究對照品種所在地塊的薯瘟致病力并將其歸類。

1.5 抗甘薯瘟病情調(diào)查與抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.5.1 病情調(diào)查標(biāo)準(zhǔn) 0 級(jí):植株正常無病;Ⅰ級(jí):拐頭維管束變褐，薯塊受害不明;Ⅱ級(jí):莖維管束褐變擴(kuò)展及地上部，薯塊受害1/4 內(nèi);Ⅲ級(jí):拐頭腐爛少結(jié)薯;Ⅳ級(jí):植株枯死。

1.5.2 抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 高抗(HR):病指＜0.5;抗病(R):病指0.6～20.5;中抗(MR):病指20.6～40.5;中感(MS):病指40.6～60.5;感病(S):病指60.6～80.5;高感(HS):病指＞80.6。

2 結(jié)果與分析

2.1 鑒定結(jié)果

2.1.1 抗瘟鑒定結(jié)果 由表1 可以看出，2010—2012 年，除2010 年有高抗薯瘟的品種出現(xiàn)外，2011 和2012 年均無高抗品種出現(xiàn)，抗病至高感品種的鑒定結(jié)果在3 年中也有所不同，抗病(R)品種在2010 年所占的比率最大達(dá)28.73%，2011—2012 兩年均低于4%。中抗至感病品種在3 年中均是逐漸增加，其中中抗品種所占的比率由2010 年的7.18%增加到2012 年的10.89%;高感薯瘟病品種2011 年所占的比率最大，2010 和2012 年兩年均在40%左右。田間發(fā)病率2011 年最高達(dá)93.02%，均高于2010 和2012 年。這一變化，主要是由于經(jīng)過2010 和2011 年連續(xù)兩年的鑒定后筆者對病圃采取了一定的栽培耕作措施，將田間土壤灌水5 天后用翻耕機(jī)進(jìn)行了大面積的“攪拌”作業(yè)，將田間的土壤均勻化，由于薯瘟病原菌屬土傳病害，可隨著病土移動(dòng)，且由于水分浸泡，可能導(dǎo)致病原菌量有所減少，所以到了2012年發(fā)病率降低。

表1 2010—2012 年抗瘟鑒定結(jié)果Tab.1 Results identification from 2010 to 2012

2.1.2 對照品種病情數(shù)據(jù) 由于每年鑒定的品種除3 個(gè)對照外均不同，所以對3 個(gè)對照品種的病情數(shù)據(jù)比較更能說明問題，由表2 可以看出全田發(fā)病率2010 年為87.95%，2011 年為95.38%，2012 年為78%。新種花的發(fā)病率2010 年為90%，其后兩年全為100%，病情指數(shù)均值均達(dá)到高感水平，其中2011年最高;金山57 發(fā)病率2010 年最低，2011 年最高，病情指數(shù)均值也是2010 年最小表現(xiàn)為中抗水平，2011 年則變?yōu)楦吒兴剑捎诮鹕?7 高抗薯瘟Ⅰ型菌，感Ⅱ型菌，所以表明2011 年度該病圃中的薯瘟Ⅱ型菌迅速增加，為了能與大田發(fā)病相一致，筆者采取了對田間土壤“泡水?dāng)嚢琛钡拇胧?，以降低Ⅱ型菌菌量，所以到?012 年其病指均值為61.3 表現(xiàn)為感病。湘薯75-55 則由2010 和2011 年的抗病變?yōu)?012 年的中抗，發(fā)病率也是在2011 年時(shí)最高，連續(xù)3 年均有發(fā)病說明病圃也存在潛伏侵染型的薯瘟菌菌株。

表2 2010—2012 年全田及對照品種發(fā)病情況統(tǒng)計(jì)Tab.2 Incidence staristics of the nursery and check varieties from 2010 to 2012

2.2 對照品種病情數(shù)據(jù)系統(tǒng)聚類分析

聚類分析是研究如何將對象按照多個(gè)方面的特征進(jìn)行綜合分類的一種統(tǒng)計(jì)方法［8］，該方法有效地解決了科學(xué)研究中多因素、多指標(biāo)的分類問題［9］。系統(tǒng)聚類是一種連續(xù)并類的過程，該過程可用一種類似于樹狀結(jié)構(gòu)的圖形即聚類譜系圖(俗稱樹狀圖)來表示，由聚類譜系圖可清楚地看出全部樣本的聚集過程，從而可做出對全部樣本的分類［10］。本研究開展了對照品種新種花、金山57、湘薯75-55 在不同地塊病情數(shù)據(jù)(各病級(jí)病株數(shù)、總株數(shù)、病株數(shù)、發(fā)病率、病情指數(shù))的系統(tǒng)聚類，數(shù)據(jù)不轉(zhuǎn)換，運(yùn)用歐式距離進(jìn)行類平均法聚類，以期通過對對照品種病情數(shù)據(jù)的聚類將其所在的田塊按照品種的發(fā)病情況進(jìn)行分類，根據(jù)分類情況，找出一定的規(guī)律，在后續(xù)的管理中采取相應(yīng)的耕作措施優(yōu)化田間土壤內(nèi)病原菌的分布，逐步使鑒定圃內(nèi)的菌系分布均勻，致病力更加均衡。鑒定結(jié)果更加可靠。

2.2.1 新種花病情數(shù)據(jù)系統(tǒng)聚類分析 根據(jù)系統(tǒng)聚類樹狀圖，新種花所在的23 個(gè)地塊(表3)可劃分為3 大類(圖1 中右分隔線所分開的Ⅰ和Ⅱ)，4 個(gè)亞類(圖1 中左分隔線所分)，如果將4 個(gè)亞類再進(jìn)行分類還可以繼續(xù)分成不通過的小類。以Ⅰ和Ⅱ兩大類為例，其中Ⅰ類只有編號(hào)為21 的這一地塊，該地塊病級(jí)低的范圍內(nèi)株數(shù)較多，在最高級(jí)別的病級(jí)中株數(shù)最少，病情指數(shù)只有62.5 為感病;第Ⅱ大類中包含了4 個(gè)地塊，這4 個(gè)地塊病情指數(shù)均在90 以上，達(dá)到高感水平。第Ⅲ大類中包含了新種花表現(xiàn)為感病和高感的地塊;在亞類的分類過程中又把第Ⅲ大類中新種花表現(xiàn)為感病和高感的地塊區(qū)分開來;說明通過聚類分析對地塊的分類與對照品種在不同地塊的發(fā)病情況相吻合，可以更直觀的區(qū)分病圃不同地塊的致病力。

2.2.2 金山57 病情數(shù)據(jù)系統(tǒng)聚類分析 根據(jù)系統(tǒng)聚類樹狀圖，金山57 所在的23 個(gè)地塊可劃分為兩大類(圖2 中右分隔線所分開的Ⅰ和Ⅱ)，第1 大類又可分為兩個(gè)個(gè)亞類(圖2 中左分隔線所分)，如果將兩個(gè)個(gè)亞類再進(jìn)行分類還可以繼續(xù)分成不通過的小類。Ⅰ和Ⅱ兩大類中Ⅱ類地塊金山57 病情指數(shù)均在20.5 以下(表4)，為抗病水平;而Ⅰ類又可以分為兩個(gè)亞類1 和2，其中第1 亞類中包含了金山57表現(xiàn)為中抗和中感的地塊;第2 亞類中包含了金山57 表現(xiàn)為感病和高感的地塊，如果把這兩個(gè)亞類繼續(xù)分類則可以把金山57 表現(xiàn)為中感、中抗、感病、高感的地塊完全分類開，說明系統(tǒng)聚類對金山57 在病圃不同地塊的抗病表現(xiàn)也能直觀的進(jìn)行分類。

圖1 新種花病情數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析Fig.1 Cluster analysis of Xinzhonghua by disease datas

圖2 金山57 病情數(shù)據(jù)系統(tǒng)聚類分析Fig.2 Cluster analysis of Jinshan57 by disease datas

表3 新種花病情數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Tab.3 Disease datas of Xinzhonghua

表4 金山57 病情數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Tab.4 Disease datas of Jinshan57

2.2.3 湘薯75-55 病情數(shù)據(jù)系統(tǒng)聚類分析 由圖3 湘薯75-55 病情數(shù)據(jù)聚類圖可以看出湘薯75-55 所分布的7 個(gè)小區(qū)依據(jù)病情數(shù)據(jù)表5 在距離1.68 的位置劃分為3 個(gè)大類別，第1 大類為小區(qū)101，該去湘薯表現(xiàn)為中感;第2 大類為小區(qū)145、88、136、31，該類小區(qū)湘薯表現(xiàn)為中抗;第3 大類為180、74，該類小區(qū)湘薯表現(xiàn)為抗病和高抗。在距離0.84 處，第2 大類又可劃分為兩個(gè)亞類群，第1 亞類群為小區(qū)145，該小區(qū)湘薯表現(xiàn)為中抗，但病級(jí)I 級(jí)的病株數(shù)為6 株，病情指數(shù)也與第2 亞類群有差別;第2 亞類群為小區(qū)88、136、31，該亞類病情指數(shù)均為25.0，表現(xiàn)為中抗。

圖3 湘薯75-55 病情數(shù)據(jù)系統(tǒng)聚類分析Fig.3 Cluster analysis of Xiangshu75-55 by disease datas

由湘薯的表現(xiàn)可以看出，整個(gè)試驗(yàn)地的小區(qū)之間可能存在著甘薯瘟II 型潛伏侵染型(小區(qū)101 表現(xiàn)為中感)，這是一類高致病型(某些研究者又稱之為Ⅲ型菌系)。同時(shí)從總的病指來看，湘薯所分布的所有小區(qū)間也存在著明顯的差別，說明病圃致病菌的分布尚需優(yōu)化。

表5 湘薯75-55 病情數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Tab.5 Disease datas of Xiangshu75-55

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)的抗瘟鑒定表明來自省內(nèi)外的572 份甘薯品種(系)抗性水平存在一定差異，從抗病鑒定對照品種(系)發(fā)病情況來看，病圃發(fā)病正常，數(shù)據(jù)可以反應(yīng)實(shí)際情況。通過運(yùn)用系統(tǒng)聚類對病圃不同區(qū)塊的發(fā)病情況進(jìn)行聚類分析，可明顯區(qū)分出病圃內(nèi)部菌系之間的差異，為下一步鑒定工作的開展提供有力的理論支持。

通過新種花、金山57、湘薯75-55 田間的布點(diǎn)分布，初步對病圃菌系變異進(jìn)行了分析，分析結(jié)果表明:該病圃不同小區(qū)間存在致病力差異，并且鑒定圃內(nèi)甘薯瘟Ⅰ、Ⅱ型菌在病圃內(nèi)的分布不均，有的小區(qū)Ⅰ型菌系占優(yōu)勢，而有的小區(qū)Ⅱ型菌系占優(yōu)勢，同時(shí)通過湘薯75-55 病情數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和分析可以看出病圃存在著甘薯瘟II 型的潛伏侵染型(Ⅲ型)菌系。所以，應(yīng)該采取相應(yīng)的措施有預(yù)見性的加以改良:

①有研究表明番茄是甘薯瘟最敏感的寄主之一［11］，甘薯瘟病地種植番茄可誘導(dǎo)病菌的長期存在和穩(wěn)定分布［12］，同時(shí)結(jié)合通過耕作和栽培措施翻耕土地，可使鑒定圃的菌力分布更加趨于均勻，經(jīng)過幾年的調(diào)整，整個(gè)鑒定圃的菌力必將能穩(wěn)定保持并分布更加均勻，使鑒定結(jié)果更加可靠。

②方樹民等［13］提出:生產(chǎn)上主要是利用抗薯瘟品種進(jìn)行防治，但其抗性易發(fā)生衰退。甘薯瘟抗病型(高抗I 型兼抗Ⅱ型)品種，與I 型主效毒性基因菌系互作表現(xiàn)抗至中抗，而病原菌系需要經(jīng)多年累積多個(gè)毒性基因才能克服它，但最終以潛伏Ⅲ型毒性基因菌系侵染薯塊的方式克服抗病型品種［14］。張連順等［15］也指出:甘薯瘟病菌分布特點(diǎn)是老病區(qū)又連續(xù)種植抗瘟品種的致病力強(qiáng)，新病區(qū)種茉抗瘟品種的致病力弱。同時(shí)，劉中華等［16］指出甘薯瘟不同致病型的基因存在一定差異，因此，本試驗(yàn)的一些數(shù)據(jù)顯示出，金山57 和湘薯75-55 發(fā)病逐年增加。

③項(xiàng)目應(yīng)對鑒定圃如何保持菌群穩(wěn)定開展相關(guān)工作:在新育成品種抗病越來越強(qiáng)的同時(shí)可將整個(gè)鑒定圃劃分為幾大塊，每年采取一定耕作措施穩(wěn)定其中部分地塊用以開展正常鑒定，一直輪換，保持鑒定的正常進(jìn)行。同時(shí)，開展相關(guān)品種基因與甘薯瘟病菌基因之間關(guān)聯(lián)的分子機(jī)理研究。

④本研究僅從相關(guān)品種種植區(qū)域的病情統(tǒng)計(jì)開始，而本試驗(yàn)中病原菌方面的研究相關(guān)工作配合不足，這是下一步開展系列研究的重點(diǎn)，在以后的相關(guān)研究中將會(huì)加以完善和落實(shí)。

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