楊 建，徐 偉，耿龍武，關(guān)海紅，黨云飛，李晨宇

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070;2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

我國約有6.9×108hm2低洼鹽堿水域，約占全國湖泊總面積的55%［1］。這些水資源的主要特點是鹽堿度高，緩沖能力差［2］，生物資源貧乏，漁業(yè)產(chǎn)量一直處于較低水平。因此，掌握不同魚類對鹽堿的耐受性及調(diào)控機制，對開發(fā)和利用這些水域具有重要的意義。近年來，針對鹽度對魚類的受精孵化率、生長發(fā)育、組織結(jié)構(gòu)和酶活力影響等進(jìn)行了較多研究［3-5］，但堿度對魚類的影響報道則相對較少。

2003 年黑龍江水產(chǎn)研究所從烏茲別斯坦外引進(jìn)了耐鹽堿魚類大鱗鲃(Barbus capito)，該魚屬鯉科，鲃亞科，鲃屬，溯河洄游性魚類，具有食性廣、生長速度快、肉質(zhì)鮮美、耐鹽堿、適應(yīng)性強等特點［6］。目前，大鱗鲃的人工繁育已獲得成功［7］，為大鱗鲃的推廣奠定了基礎(chǔ)。目前，我國低洼鹽堿水域面臨著養(yǎng)殖品種單一，生產(chǎn)效益不高等難題［2］，急需引入新的耐鹽堿魚類品種，本研究比較了大鱗鲃與草魚(Ctenopharyngodon idllus)、鏡鯉(Songpu mirror carp)、鯽魚(Carassius auratus)和白鰱(Hypophthalmichthys molitrix)等幾種常見池塘養(yǎng)殖魚類在NaHCO3堿度脅迫下的耐受性能及其對組織影響，以期為鹽堿水域的漁業(yè)開發(fā)利用提供參考。本研究利用NaHCO3溶液對大鱗鲃、草魚、鏡鯉、鯽魚和白鰱進(jìn)行堿度急性毒性試驗，比較5 種幼魚對堿度的耐受性，并通過鰓、腎組織的病理切片觀察，探索魚類在高堿脅迫下不同魚類組織結(jié)構(gòu)的變化。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大鱗鲃、草魚、鏡鯉、鯽魚和白鰱均為黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭試驗站培育50 d 左右的健康幼魚。試驗前在室內(nèi)停食暫養(yǎng)2 d，試驗用水為曝氣的池塘用水，鹽度為0.56 g/L，堿度為4.2 mmol/L，pH 為7.93，硬度為234 mg/L，氨氮0.69 mg/L 和總鐵0.64 mg/L。試驗容器是規(guī)格為64 cm×45 cm×28 cm白色硬質(zhì)塑料箱，試驗用NaHCO3及其它藥品均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗方法

試驗前進(jìn)行5 種幼魚NaHCO3脅迫預(yù)實驗，然后根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果分別設(shè)置5 個堿度梯度及1 個對照組，每個濃度梯度設(shè)置3 個平行，實驗結(jié)果取其平均值。試驗溶液按每組50 L 水稱取相應(yīng)質(zhì)量的NaHCO3配制，配制好后穩(wěn)定24 h，用滴定法測定每個試驗組的堿度，對濃度偏差較大的組別進(jìn)行調(diào)整并再次測定其濃度，5 種魚類的NaHCO3預(yù)設(shè)濃度和實測濃度見表1。每個濃度組隨機放入幼魚10 尾，試驗期間不換水，不通氣，靜止放置96 h。試驗期間溶解氧含量為6.53～6.71 mg/L，氨氮含量為，0.69～0.77 mg/L，溫度為21.5～23.5 ℃。對5 種幼魚死亡的判別標(biāo)準(zhǔn)是:幼魚失去游泳能力，輕觸魚體無反應(yīng)即視為死亡。

表1 5 種幼魚堿度試驗濃度梯度Tab.1 Concentration gradient of alkalinity in juveniles of 5 species

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計、樣本采集及檢測

觀察和統(tǒng)計12 h，24 h，48 h，72 h，96 h 各濃度組試驗魚的活動情況，記錄死亡時間和尾數(shù)，并立即采集死亡個體的鰓、腎組織。每種魚每種組織分別取3 個樣，浸泡在Bouins 液中固定。固定24 h 后，用70%的乙醇洗滌2～3 次，再保存于70%的乙醇中。固定好的組織用石蠟包埋，切片，厚度為5 μm，HE 染色，中性樹膠封片，用Motic 2.0 光學(xué)顯微鏡觀察、拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)利用Excel 軟件(07 版)整理，并采用數(shù)據(jù)處理軟件SPSS17.0 進(jìn)行方差分析和半數(shù)致死濃度的計算［8］，P＜0.05 視為有統(tǒng)計學(xué)意義。采用t-檢驗對5 種魚類的24 h，48 h，72 h，96 h 的堿度半致死濃度(Half lethal concentration，LC50)進(jìn)行差異分析，P＜0.05 為差異顯著。采用安全濃度(Safe Concentration，SC)常用計算公式SC=96 h LC50×0.1［9］計算出堿度對5 種魚類的安全濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaHCO3堿度脅迫下5 種幼魚的行為反應(yīng)

5 種幼魚放入高濃度NaHCO3溶液后，初期表現(xiàn)為繞試驗容器迅速的游動，大鱗鲃、鏡鯉、鰱魚甚至出現(xiàn)跳出容器;隨著試驗時間的延長，幼魚出現(xiàn)狂游，且在游動時，身體出現(xiàn)側(cè)翻現(xiàn)象，無法維持身體平衡;隨后，幼魚的游泳速度逐漸變得緩慢，活動減弱，對外界刺激反應(yīng)減弱，最后死亡;在魚體死亡前，鯽魚雖無鰓動，但較長時間仍能對外界刺激有反應(yīng)，而其它幼魚無鰓動即刻死亡;5 種幼魚出現(xiàn)異常反應(yīng)的時間都會隨著NaHCO3濃度的升高而縮短。在試驗期間幼魚體表粘液的分泌則減少，魚體表層變黑，失去光澤，個別眼睛發(fā)白，鰓部出血。而對照組在整個試驗期間，5 種幼魚游泳行為正常，體表無異常變化，無死亡現(xiàn)象。

表2 5 種幼魚在不同NaHCO3濃度下的死亡率Tab.2 Mortality in different concentrations of NaHCO3in juveniles of 5 species

2.2 不同NaHCO3濃度下的死亡率

5 種幼魚在不同NaHCO3濃度下12 h，24 h，48 h，72 h 和96 h 時的死亡率見表2。結(jié)果顯示，5 種幼魚的死亡率隨著時間的延長、NaHCO3濃度的增大而升高，毒性效應(yīng)與曝露時間、NaHCO3濃度呈正相關(guān)。

2.3 不同NaHCO3濃度下的半致死濃度

通過5 種幼魚的死亡率計算獲得NaHCO3半致死濃度，以及死亡率與NaHCO3濃度的關(guān)系方程(表3)。5 種幼魚的NaHCO3堿度96 h 半致死濃度(LC50)分別為:大鱗鲃123.097 mmol/L，草魚92.936 mmol/L，鏡鯉113.038 mmol/L，鯽魚139.832 mmol/L，白鰱87.970 mmol/L，通過經(jīng)驗公式計算得出5 種幼魚的NaHCO3安全濃度分別為12.310 mmol/L，9.294 mmol/L，11.304 mmol/L，13.983 mmol/L，8.797 mmol/L。由5 種幼魚的NaHCO3半致死濃度和安全濃度可知，耐受能力大小順序依次為:鯽魚，大鱗鲃，鏡鯉，草魚，白鰱。

表3 5 種幼魚的急性堿度半致死濃度Tab.3 Acute LC50of alkalinity in juveniles of 5 species

對5 種魚類幼魚的曝露時間和對應(yīng)的NaHCO3半致死濃度作圖，得到5 種幼魚的NaHCO3濃度反應(yīng)曲線(圖1)。5 種魚類的NaHCO3半致死濃度隨著時間的延長而降低，大鱗鲃、鏡鯉和白鰱的NaHCO3毒性反應(yīng)曲線趨于平緩，這表明幼魚的NaHCO3LC50不再繼續(xù)降低，死亡率不再升高;草魚和鯽魚的NaHCO3毒性反應(yīng)曲線仍呈下降的趨勢，死亡率隨時間延長仍有所降低。由圖1 可知，鏡鯉在曝露48 h 時反應(yīng)曲線即趨于平穩(wěn)，鯽魚和白鰱在曝露72 h 趨于平穩(wěn)，而大鱗鲃和草魚在試驗終止反應(yīng)曲線也未完全與橫軸平行，這說明在堿度脅迫下的適應(yīng)時間鏡鯉最短，其次為鯽魚和白鰱，大鱗鲃和草魚較長。

2.4 NaHCO3堿度脅迫下5 種幼魚鰓、腎組織的結(jié)構(gòu)變化

通過觀察發(fā)現(xiàn)，對照組5 種幼魚的鰓絲分布均勻，細(xì)胞飽滿，排列緊密;鰓小片均勻的分布在鰓絲兩側(cè)，鰓小片上皮細(xì)胞飽滿無損傷，大鱗鲃、鯽魚和鏡鯉的鰓絲較草魚、白鰱密集，鰓小片結(jié)構(gòu)也較草魚和白鰱復(fù)雜(圖2，1～5)。但在高濃度NaHCO3脅迫下，鰓結(jié)構(gòu)變化基本相同，鰓小片縮短，細(xì)胞間隙增大，鰓小片上皮細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的水腫，甚至脫落現(xiàn)象(圖2，6～10)。

圖1 5 種幼魚的急性堿度反應(yīng)Fig.1 Acute alkalinity response in juveniles of 5 species

通過觀察發(fā)現(xiàn)，對照組的腎組織結(jié)構(gòu)充實，腎小球發(fā)達(dá)，腎小管粗壯;結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞無損傷，5 種幼魚的腎組織結(jié)構(gòu)無明顯的差異(圖3，11～15)。但在高NaHCO3濃度試驗組中，腎小管上皮細(xì)胞會出現(xiàn)不同程度的萎縮，腎小管管腔變大(圖3，11～15)。

圖2 NaHCO3對5 種幼魚鰓組織的影響Fig.2 Impact of NaHCO3on gill structure in juveniles of 5 species

圖3 NaHCO3對5 種魚類腎臟組織的影響Fig.3 Impact of NaHCO3on kidney structure in juveniles of 5 species

3 討論

3.1 NaHCO3堿度對魚類的急性毒性作用

我國低洼鹽堿地區(qū)的水型較復(fù)雜，離子組成不盡相同，其中CO32-、HCO3-是影響水體中堿度的主要離子，直接或間接的影響了水生生物的生長和生存［10］。一般在實驗室條件下，多數(shù)研究者都會使用NaHCO3濃度作為生物耐堿能力的指標(biāo)［5，11-12］。魚類在高堿度水體中，組織器官會產(chǎn)生相應(yīng)的損傷和結(jié)構(gòu)變化。史為良在對達(dá)里湖魚類進(jìn)行調(diào)查時發(fā)現(xiàn)雅羅魚體表潰爛，爛鰭或瞎眼［13］，雷衍之等報道在高堿度水體中鰱魚、鳙魚(Aristichthys nobilis)和草魚鰓部出血［14］。本研究選擇NaHCO3進(jìn)行了5 種魚類的堿度毒性試驗，并發(fā)現(xiàn)在高堿度溶液中魚體表層變黑，失去光澤，個別個體出現(xiàn)眼睛發(fā)白、鰓部出血現(xiàn)象。

史為良在對達(dá)里湖魚類進(jìn)行調(diào)查時認(rèn)為魚類的死亡是由高pH 與高堿度的共同作用引起，并發(fā)現(xiàn)達(dá)里湖魚類的死亡與CO32-、HCO3-的含量有關(guān)［13］;雷衍之等在研究碳酸鹽對魚類的毒性作用時著重分析了CO32-、HCO3-和OH-的相互作用關(guān)系，得出堿度相同時，pH 越高，致死作用越大;pH 相同時，堿度越大，致死作用也越大。在高堿度條件下，幾種魚類的耐受能力大小依次為青海湖裸鯉(Gymnocypris przewalskii)，瓦氏雅羅魚(Leuciscus waleckii)，鯽魚，鯉魚(Cyprinus carpio)，尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)，草魚，鳙魚，鰱魚［14］。本研究也發(fā)現(xiàn)在正常pH 范圍內(nèi)，5 種幼魚死亡率隨著NaHCO3濃度增大、曝露時間、延長而升高，且不同品種的幼魚對堿度的耐受力存在顯著差異，耐受力大小依次為鯽魚，大鱗鲃，鏡鯉，草魚，鰱魚，這些結(jié)果與史為良和雷衍之等研究結(jié)果相近。

研究表明，廣鹽性硬骨魚類由淡水中轉(zhuǎn)入高鹽度水體中，魚體組織結(jié)構(gòu)和生理機能會產(chǎn)生適應(yīng)性改變［15-16］，魚類在堿性水體中也存在相似的適應(yīng)性變化，但這種適應(yīng)不能超過魚體的耐受極限［17-19］。此外，魚類對堿度的適應(yīng)因種類的不同而呈現(xiàn)多樣性，本研究發(fā)現(xiàn)5 種魚類曝露在相同堿度下出現(xiàn)的生理反應(yīng)和效應(yīng)時間各有差異，如鯽魚在死亡前，雖無鰓動，但較長時間仍能對外界刺激有反應(yīng)，而其它幼魚無鰓動即刻死亡。

3.2 NaHCO3堿度對魚類鰓、腎組織結(jié)構(gòu)的影響

鰓是魚類與外界環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換的主要器官，易于受到外界環(huán)境的干擾而影響其正常生理功能的進(jìn)行。魚類在對堿度脅迫的適應(yīng)過程中，鰓的組織結(jié)構(gòu)也發(fā)生不同程度的適應(yīng)性改變。姜秋俚等發(fā)現(xiàn)高NaHCO3作用下咸海卡拉白魚(Chalcalburnus chalcoides aralensis)的鰓小片縮短，鰓小片上皮細(xì)肥大，腫脹和脫落［20］。本研究也發(fā)現(xiàn)在高堿度試驗組中，5 種試驗幼魚的鰓小片縮短，細(xì)胞間隙增大，導(dǎo)致鰓絲萎縮。這是由于水體中的堿度增大，部分離子進(jìn)入血液中，血漿的滲透壓會升高，魚體為了滿足滲透調(diào)節(jié)的能量需求，鰓組織結(jié)構(gòu)隨即發(fā)生適應(yīng)性變化。筆者認(rèn)為鰓絲萎縮使得鰓小片間隙增大，流經(jīng)鰓絲的水量增大;鰓絲直徑減小，使得比表面積*增大，這些都會有利于氧氣的攝取及能量物質(zhì)的分解，這一結(jié)論還需進(jìn)一步的實驗證明。

魚類的腎臟是魚體進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)的重要器官，外界環(huán)境的異常會導(dǎo)致腎組織結(jié)構(gòu)相應(yīng)的變化，因此，可作為魚類鹽堿度適應(yīng)范圍和最適鹽堿度的指標(biāo)［21］。研究發(fā)現(xiàn)，在低滲環(huán)境下腎組織結(jié)構(gòu)充實，腎小球發(fā)達(dá)，腎小管粗壯;而在高滲條件下，腎臟會退化，腎小球縮小甚至消失，腎小管縮短［22］。D L Galat等對生活在不同鹽堿湖泊的褐色鮭(Salmo clarki lewisi)等的腎臟進(jìn)行觀察時也得到了相同的結(jié)論［23］，姜秋俚等也發(fā)現(xiàn)在NaHCO3堿度脅迫下卡拉白魚的腎臟也發(fā)生類似的變化［17］。本試驗對照組幼魚腎臟組織結(jié)構(gòu)充實，腎小球發(fā)達(dá)，腎小管粗壯，但在高濃度NaHCO3試驗組也觀察到的腎組織腎小管出現(xiàn)不同程度的萎縮，腎小管管腔變大。這可能是由于在高堿度水體中，魚體的滲透壓會隨之升高，為了維持體內(nèi)的平衡，魚體就會補充大量的水分，這時腎組織排出的水分相應(yīng)減少，而腎小管就會出現(xiàn)不同程度的萎縮。

在高鹽堿水體中，魚類除了鰓和腎臟組織參與離子的調(diào)控和滲透壓的調(diào)節(jié)，Nelsen 等在對褐色鮭的研究中發(fā)現(xiàn)，幽門盲囊也參與了滲透壓的調(diào)節(jié)［24］。此外，童燕，Rotllant J 和徐力文等認(rèn)為魚體中腎上腺皮質(zhì)激素［25］、消化酶、堿性磷酸酶和非特異性免疫酶類［26-27］等參與滲透壓的調(diào)節(jié)。由此可知，魚類在異常的鹽堿環(huán)境中滲透壓調(diào)節(jié)是由多個器官間協(xié)同作用來維持的，因而要想查清魚類在鹽堿條件下的滲透壓調(diào)控機制仍需要進(jìn)行進(jìn)一步的探索。

* 注:比表面積(specific surface area)是指單位質(zhì)量物料所具有的總面積，是表示固體吸附能力的重要參數(shù)。比表面和粒度有一定關(guān)系的，根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB1774-88 比表面與粉末粒度關(guān)系的計算公式(假定為球形)為:d=6/ps，其中d—平均粒徑(μm)，ρ—密度(g/cm3)，S—比表面(m2/g)。

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