彭亦谷，趙彩鐲，胡 榮，馬宇熙，王子榮

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品與藥品學(xué)院，新疆烏魯木齊830052)

鈣是人體內(nèi)必需的元素之一，它是構(gòu)成人體骨骼、牙齒、器官、血液、肌肉組織的重要成分，當(dāng)人體中缺乏鈣可能發(fā)生生理功能障礙［1-2］。氨基酸螯合鈣是一個(gè)或者多個(gè)氨基酸基團(tuán)與金屬鈣發(fā)生配合反應(yīng)形成的具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的化合物。其具有良好的化學(xué)和生化穩(wěn)定性，易于被人體吸收、副作用小、生物利用率高［3-4］，能達(dá)到既補(bǔ)充氨基酸又補(bǔ)充鈣的雙重功效，是一種較理想的鈣營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑［5-6］。而蛋殼中含有豐富的鈣，從畜牧學(xué)角度分析它是一種完全高度結(jié)合的生物鈣源，天然、安全［7］。H．Z．Walton 對(duì)沒(méi)經(jīng)過(guò)水洗處理的雞蛋殼中所含化學(xué)元素進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其中鈣含量高達(dá)36．4%［8］，并且還有一些機(jī)體必要微量元素。按蛋殼占蛋重的12%～13%［9］進(jìn)行計(jì)算，近些年來(lái)我國(guó)每年扔掉的雞蛋殼達(dá)400×104t［10］左右，對(duì)環(huán)境造成污染以及資源的極大浪費(fèi)。這迫切需要新技術(shù)手段來(lái)對(duì)蛋殼進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)資源化利用，既可以變廢為寶，高價(jià)值化利用蛋殼，又可以解決蛋殼對(duì)環(huán)境造成的污染;活躍我國(guó)鈣制劑市場(chǎng)，改善我國(guó)居民缺鈣的現(xiàn)狀。因此研究以雞蛋殼為鈣源制備谷氨酸螯合鈣的技術(shù)具有較高的實(shí)際意義和開(kāi)發(fā)價(jià)值。

目前，對(duì)蛋殼鈣源的利用制備鈣制劑主要是乳酸鈣、檸檬酸鈣及蘋(píng)果酸鈣等第二代鈣制劑，主要采用酸解提取可溶性鈣、高溫煅燒法，方法普遍存在造成酸污染以及環(huán)境污染，有機(jī)溶劑殘留等缺陷［11-12］，而本實(shí)驗(yàn)采用雞蛋殼與氨基酸直接反應(yīng)制取氨基酸螯合鈣，這種研究方法報(bào)道較少，相對(duì)于前者具有綠色環(huán)保，工藝簡(jiǎn)便易行等優(yōu)點(diǎn)。氨基酸螯合鈣是第三代鈣制劑鈣元素可以通過(guò)小腸絨毛刷狀緣，以氨基酸或肽的形式直接從腸黏膜吸收，有效避免一些理化因子的影響，如pH、脂類(lèi)、纖維、草酸、植酸等的影響，其生物學(xué)利用率高，從而有效解決傳統(tǒng)鈣制劑產(chǎn)生的溶劑性差、吸收利用低、產(chǎn)生結(jié)石等問(wèn)題。因此，本實(shí)驗(yàn)采用直接反應(yīng)制取氨基酸螯合鈣法，對(duì)摩爾比、pH、螯合溫度、螯合時(shí)間4個(gè)參數(shù)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，獲得最佳工藝參數(shù)，以此為雞蛋殼的深度開(kāi)發(fā)以及氨基酸螯合鈣制劑的綜合利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原料 雞蛋殼，收集于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)生食堂餐廳，蛋品種為海蘭褐雞蛋，收集時(shí)間清晨新鮮廢棄蛋殼;L-谷氨酸 北京博泰克生物基團(tuán)技術(shù)有限責(zé)任公司;無(wú)水乙醇、EDTA二鈉鹽、三乙醇胺 天津市福晨化學(xué)試劑廠;鉻黑T 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;鹽酸 天津化學(xué)試劑三廠;氨水 四川西隴化工有限公司。

FW-100高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 北京市永光明醫(yī)療儀器廠;EYELA SB2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛(ài)朗儀器有限公司;DHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海恒科技有限公司;100目國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)篩 上海東星建材實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;AL204-IC電子分析天平 上海市梅特勒-托利多有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器廠;PHS-3c酸度計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;FOODALYT-TS10滴定儀 北京天翔飛域儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 原料預(yù)處理 蛋殼收集后，清水清洗表面雜物，沸水煮沸5～10min，超聲波殼膜分離，置100℃烘箱中烘干，粉碎過(guò)100目篩，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．2 谷氨酸螯合鈣制備工藝流程 谷氨酸、鈣源蛋殼粉和蒸餾水一定比例混合→調(diào)節(jié)pH→加熱→攪拌→保溫螯合→抽濾→上清液減壓濃縮置膏狀→乙醇沉淀→離心→收集沉淀物→干燥→粉碎→谷氨酸螯合鈣

1．2．3 谷氨酸螯合鈣螯合率的測(cè)定 稱(chēng)取1．00g氨基酸螯合鈣樣品，溶于蒸餾水定容500mL，取100mL置300mL錐形瓶中，加入5滴1%鉻黑T指示劑和NH3·H2O-NH4Cl緩沖溶液 5mL 搖勻。0．01mol/L EDTA溶液滴定，平行進(jìn)行3次滴定，記下消耗的EDTA溶液平均體積V0。另取相同量氨基酸螯合鈣樣品，加50mL無(wú)水乙醇，充分?jǐn)嚢桦x心、分離、烘干，用蒸餾水定容至500mL，方法同上，記下消耗的EDTA溶液平均體積V1，由此計(jì)算出螯合率和金屬元素的總含量。

式中:C標(biāo)定EDTA溶液的濃度mol/L;V1滴定螯合態(tài)鈣元素消耗的EDTA溶液體積mL;V0滴定鈣元素總量消耗的EDTA溶液體積mL;M為鈣元素的相對(duì)分子量g/mol;m為稱(chēng)取的樣品量g。

1．2．4 影響螯合率的單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過(guò)單因素分別考察不同pH、摩爾配比、溫度、反應(yīng)時(shí)間4個(gè)主要影響因素對(duì)氨基酸螯合鈣螯合率的影響，為響應(yīng)面組合實(shí)驗(yàn)各因素水平設(shè)計(jì)提供有意義的取值范圍。

1．2．4．1 摩爾比對(duì)螯合率的影響 分別以 4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5 摩爾比，在 pH7、溫度 70℃的水浴中保溫螯合60min，考察不同摩爾比對(duì)螯合率的影響。

1．2．4．2 pH對(duì)螯合率的影響 調(diào)節(jié)混合液pH分別為 3、4、5、6、7、8、9、10，在摩爾比為 1∶3、溫度 70℃的水浴中保溫螯合60min，考察不同pH對(duì)螯合率的影響。

1．2．4．3 溫度對(duì)螯合率的影響 在 pH 為7，蛋殼粉與谷氨酸摩爾比為1∶3，螯合時(shí)間60min，選取螯合溫度 30、40、50、60、70、80、90、100℃。

1．2．4．4 時(shí)間對(duì)螯合率的影響 在 pH7、70℃、蛋殼粉與谷氨酸摩爾比為1∶3條件下，螯合溫度為30、40、50、60、70、80、90、100、110、120min 選取不同時(shí)間進(jìn)行保溫螯合。

1．2．5 響應(yīng)面的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇出最優(yōu)條件范圍，通過(guò)Box-Behnken Design進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，分析pH、摩爾配比、溫度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)響應(yīng)值的影響，得出最佳工藝參數(shù)。實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，響應(yīng)面設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 谷氨酸螯合鈣響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 Experimental factors and levels

2 結(jié)果與分析

2.1 谷氨酸螯合鈣制備工藝條件的單因素實(shí)驗(yàn)

2．1．1 蛋殼粉與谷氨基酸不同摩爾比對(duì)螯合率的影響 由圖1可知，在蛋殼粉與谷氨酸摩爾比從4∶1變化到1∶3的過(guò)程中，螯合率顯著增加，在摩爾比為1∶3時(shí)達(dá)到最高值;但隨著摩爾比調(diào)至1∶4、1∶5時(shí)，螯合率呈下降趨勢(shì)。這是因?yàn)樘妓徕}與谷氨酸反應(yīng)合成谷氨酸螯合鈣，反應(yīng)物的摩爾比理論值為1∶2，反應(yīng)體系中谷氨酸與鈣源蛋殼粉中的CaCO3的摩爾比高，將有利于鈣離子的螯合完全，但是氨基酸利用率低，造成能源浪費(fèi)，產(chǎn)品中鈣濃度低。

2．1．2 不同pH對(duì)谷氨酸螯合鈣螯合率的影響 由圖2可以看出，pH對(duì)螯合率有明顯影響，在pH由3上升到5過(guò)程中螯合率迅速減小，這可能是由于谷氨酸是酸性氨基酸，當(dāng)其反應(yīng)體系在酸性條件下時(shí)CaCO3直接先發(fā)生酸溶解反應(yīng)從而有利于螯合率的提高。pH由5再上升到7時(shí)螯合率迅速增大，在pH8～10之間螯合率逐漸減低，pH為7時(shí)達(dá)到最大值，分析原因可能是當(dāng)溶液中H+大量存在時(shí)，H+將會(huì)與Ca2+爭(zhēng)奪電子基團(tuán)，不利于螯合物的形成，在pH為7時(shí)，氨基酸受H+和OH-影響較小，提供了充分的供電子基團(tuán)，從而有利于鈣通過(guò)配位鍵形成螯合物［13-14］。

圖1 不同摩爾比對(duì)螯合率的影響Fig．1 Effects of different molar ratio of chelating rate

圖2 不同pH對(duì)螯合率的影響Fig．2 Effect of different pH on the chelating rate

2．1．3 不同溫度對(duì)谷氨酸螯合鈣螯合率的影響 由圖3可知，隨著溫度的提高，螯合鈣的螯合率增大，70℃時(shí)螯合率最高，但溫度進(jìn)一步升高，螯合率呈下降趨勢(shì)，其原因可能是溫度過(guò)高而引起其他復(fù)雜反應(yīng)導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量減少。

圖3 不同溫度對(duì)螯合率的影響Fig．3 Effects of different temperature on the chelating rate

2．1．4 螯合時(shí)間對(duì)谷氨酸螯合鈣螯合率的影響 由圖4可知，隨著螯合時(shí)間的延長(zhǎng)螯合率先增高后降低，當(dāng)螯合時(shí)間為60min時(shí)，螯合率達(dá)到最大值，若時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，螯合率有明顯的降低，可能是由于攪拌作用引起螯合物的降解，導(dǎo)致螯合率的降低。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Behnken Design實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

2．2．1 模型方差分析 表2是29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)結(jié)果，29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)分為兩類(lèi):一是析因點(diǎn)，自變量取值在A、B、C、D所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，共有24個(gè)析因點(diǎn);二是零點(diǎn)，為區(qū)域中心點(diǎn)，零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，用來(lái)估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差，以得率為響應(yīng)值(Y)，利用DesignExpert8．0軟件進(jìn)行二次多元回歸擬合，分別得到表3回歸方程模型方差分析及表4回歸方程系數(shù)顯著性分析。

表3 回歸方程模型方差分析Table 3 Analysis of variance for regression equation model

由表3方差分析結(jié)果可看出，模型p＜0．0001，方程模型達(dá)到極顯著，失擬 p=0．7261 ＞0．05，不顯著，因此二次模型成立，應(yīng)用此方程可以預(yù)測(cè)谷氨酸螯合鈣的螯合率及優(yōu)化工藝。對(duì)表3中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到自變量與螯合率率(Y)的二次多項(xiàng)回歸方程:Y=63．95+6．55A-1．98B-2．17C-0．51D+2．86AB+1．86AC+0．74AD+1．07BC-2．64BD-0．40 CD-8．96A2-6．77B2-4．06 C2-3．69D2

表4 回歸方程系數(shù)顯著性分析Table 4 Significance test for each regression coefficient of developed regression equation

由表4可知，影響氨基酸螯合鈣螯合率的因素主次為:摩爾比＞pH＞溫度＞時(shí)間。其中摩爾比、溫度及pH達(dá)到極顯著程度，螯合時(shí)間為顯著，且摩爾比與pH、摩爾比與溫度、pH與時(shí)間，pH與溫度有交互作用，達(dá)到極顯著水平。

2．2．2 響應(yīng)面分析 谷氨酸螯合鈣制備工藝中摩爾比、溫度、pH、時(shí)間4個(gè)因素之間交互作用對(duì)螯合率的影響如下。

由圖5可知摩爾比與pH對(duì)螯合鈣的螯合率的影響均呈拋物線形，即隨摩爾比和pH同時(shí)增大，螯合率呈先增大后降低的趨勢(shì)，因此在制備工藝中適當(dāng)增大摩爾比和pH可以提高螯合率。從圖6可以看出，隨著溫度和摩爾比值提高，螯合率也表現(xiàn)為先增大后緩慢降低，由此可見(jiàn)，適當(dāng)?shù)奶岣吣柋燃膀蠝囟?，可以一定程度提高螯合率。在圖7中，隨著時(shí)間和pH的增大，螯合率達(dá)到最大值;當(dāng)時(shí)間和pH繼續(xù)增大時(shí)，螯合率緩慢降低，因此在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)控制pH和反應(yīng)溫度在最佳范圍。從圖8中可知，隨著pH的增大和時(shí)間的延長(zhǎng)，螯合率也不斷增加，但當(dāng)達(dá)到一定值時(shí)，螯合率出現(xiàn)有下降的趨勢(shì)，控制好時(shí)間和pH的影響對(duì)實(shí)際生產(chǎn)有實(shí)際意義。

圖5 摩爾比和pH交互影響螯合率響應(yīng)面圖(C=0，D=0)Fig．5 Response surface for the effect of cross-interaction between molar ratio and pH on chelating rate(C=0，D=0)

圖6 摩爾比與溫度交互影響螯合率響應(yīng)面圖(B=0，D=0)Fig．6 Response surface for the effect of cross-interaction between molar ratio and temperature on chelating rate(B=0，D=0)

圖7 pH與時(shí)間交互影響螯合率響應(yīng)面圖(A=0，C=0)Fig．7 Response surface for the effect of cross-interaction between pHand time on chelating rate(A=0，C=0)

2.3 最佳工藝參數(shù)確定及驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

通過(guò)對(duì)2．2．1中模型方差分析得出最佳的工藝參數(shù)為:氨基酸與蛋殼粉摩爾比為 3．3∶1，pH 等于 6．9，螯合溫度為69．1℃，螯合時(shí)間60．1min，在此條件下螯合率為65．34%。為檢驗(yàn)響應(yīng)面法優(yōu)化以雞蛋殼為鈣源谷氨酸螯合鈣工藝的可靠性，采用優(yōu)化后的工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，參考實(shí)際操作，將優(yōu)化后的工藝參數(shù)調(diào)整為氨基酸與蛋殼粉摩爾比為3∶1，pH等于7，螯合溫度為70℃，螯合時(shí)間60min。在此最佳條件下，螯合率為(63．88 ±0．15)%，與模型預(yù)測(cè)值的誤差為 1．5%，接近預(yù)測(cè)值，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

圖8 pH與溫度交互影響螯合率響應(yīng)面圖(A=0，D=0)Fig．8 Response surface for the effect of cross-interaction between pH and temperature on chelating rate(A=0，D=0)

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)，得出影響螯合率的工藝因素按主次順序?yàn)槟柋龋緋H＞溫度＞時(shí)間，制備最佳條件為:谷氨酸與蛋殼粉摩爾比為3∶1，pH等于7，螯合溫度為70℃，螯合時(shí)間60min。在最優(yōu)條件下，螯合率為(63．88 ±0．15)%。

本實(shí)驗(yàn)采用廢棄雞蛋殼這種生物組織為材料與氨基酸直接反應(yīng)制取氨基酸螯合鈣技術(shù)不僅螯合率較高，而且制備過(guò)程相對(duì)于高溫煅燒、酸溶解法具有節(jié)能環(huán)保，可有效提高生產(chǎn)效率，生產(chǎn)成本低，市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)。優(yōu)化的制備工藝，可用于雞蛋殼資源利用及產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，帶動(dòng)禽蛋殼綜合利用以及鈣制劑市場(chǎng)的發(fā)展。

［1］葉強(qiáng)，葛毅強(qiáng)．鈣作用機(jī)理及鈣制劑的研究［J］．食品研究與開(kāi)發(fā)，1998(1):26-29．

［2］高憲楓，鄭建仙．論鈣的營(yíng)養(yǎng)與強(qiáng)化［J］．食品與發(fā)酵工業(yè)，1999，25(4):48-52．

［3］Marchetti Mario，Dew ayne Ashmea H，Tossania，et al．Comparison of the rates of Vitam in Degradation when mixed with Metal sulphate or metal amino acid chelates［J］．Joural of food composition and analysis，2000，13(6):875-884．

［4］Syiwia Merkiei，Wojciech Chalcarz．Modifying salt intake to prevent hypertension［J］．New Medicine，2006(2):30-34．

［5］Meisel H．Biochemical properties of bioactive peptides derived from milk proteins:potentialnutraceuticals for food and pharmaceutical applications［J］．Livestock Production Science，1997，50(1):125-138．

［6］王文新，楊柳，李繼，等．新型食品添加劑谷氨酸鈣［J］．中國(guó)調(diào)味品，2009，34(3):85-87．

［7］杜冰，蔡巽楷，謝伊澄，等．蛋殼粉制備氨基酸螯合鈣工藝優(yōu)化［J］．食品工業(yè)科技，2011，32(4):287-290．

［8］褚慶環(huán)．蛋品加工工藝學(xué)［M］．北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，2007:3-5．

［9］賓冬梅，馬美湖，易誠(chéng)．蛋殼資源綜合利用現(xiàn)狀與對(duì)策［J］．食品研究與開(kāi)發(fā)，2006，27(8):212-216．

［10］馬美湖．我國(guó)蛋禽產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及需解決的重大科技問(wèn)題［J］．華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):科學(xué)社會(huì)版，2010(5):12-18．

［11］潘旭琳，魏春紅．利用蛋殼制備醋酸鈣的工藝研究［J］．農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2009，12:57-59．

［12］張曉旭，趙國(guó)琦．蛋殼的開(kāi)發(fā)與利用［J］．飼料工業(yè)，2009，30(11):55-58．

［13］邵江娟，王唯，陳斌寅，等．以牡蠣殼為鈣源的L-天冬氨酸螯合鈣的合成及其生物利用度研究［J］．南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，28(4):371-373．

［14］邢穎．氨基酸金屬離子鰲合物合成條件及測(cè)定方法的研究［D］．武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011:38．