梁麗琴，程琳，李繼變，段江燕

（山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西臨汾041004）

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，EC1.15.1.1簡(jiǎn)稱SOD）能夠催化超氧化物自由基歧化為O2與H2O，從而防止因超氧自由基在生物體內(nèi)的過多積累而引起疾病或衰老，是一種具有重要生物醫(yī)學(xué)意義的金屬酶。據(jù)其活性部位結(jié)合金屬離子的不同，目前生物體中已發(fā)現(xiàn)的SOD主要有Cu、Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD及Ni-SOD4種。

由于動(dòng)物血液具有疾病多，價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，因而以成本低廉，SOD含量豐富且無污染的植物為材料提取SOD勢(shì)在必行；水稻、玉米、沙棘、大豆中的SOD提取純化目前已有較全面的研究[1]，而綠豆芽中的SOD提取純化研究則較少；此外，天然SOD穩(wěn)定性差，易失活，不能重復(fù)利用，而固定化酶則可克服以上缺點(diǎn)，為此，以綠豆芽為材料提取純化SOD，并對(duì)其加以固定化，從而為將SOD更好的應(yīng)用于食品及醫(yī)藥工業(yè)奠定理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

綠豆種子（中綠一號(hào)）、牛血清白蛋白、鄰苯三酚、硫酸銨（（NH4）2SO4）、丙烯酰胺（Acr）、N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺（Bis）、四甲基乙二胺（TEMED）、乙二胺四乙酸（EDTA）、過硫酸銨（AP）、二乙胺基乙基纖維素、考馬斯亮藍(lán)（G250）等為分析純。

1.2 主要儀器

TGL-16G-A型高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；UV-7504型紫外可見分光光度計(jì)：上海欣茂儀器有限公司；HD-2001-B-C型核酸蛋白檢測(cè)儀：上海嘉鵬科技有限公司；層析實(shí)驗(yàn)冷柜：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DYY-2C型電泳儀及DYCZ-24D型雙垂直電泳槽：北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 SOD粗酶液的制備

綠豆用沸水沖洗3次，25℃恒溫箱培養(yǎng)7 d，取去根尖的綠豆胚20 g研磨成勻漿，加30 mL 0.05 moL/L磷酸緩沖液混勻，用四層紗布過濾。濾液經(jīng)高速冷凍離心機(jī)離心15min（4000r/min，4℃），上清液即粗提酶液。

1.3.2 SOD酶液的純化

向粗提酶液中加硫酸銨至30%、35%、40%、45%飽和度，混勻，4℃靜置過夜，離心15min（4℃，4000 r/min），取上清液，繼續(xù)加硫酸銨至80%飽和度，靜置6 h后離心 15 min（4℃，4000 r/min），沉淀用 5 mL 0.025 mol/L pH7.8的磷酸緩沖液溶解。溶解液加入1.25 mL95%冷乙醇和0.75 mL冷氯仿，邊加邊攪拌，10000 r/min離心10 min，取上清液對(duì)蒸餾水透析過夜。透析液用聚乙二醇濃縮至一定體積。濃縮液用DEAE-纖維素-32上柱（2 cm×40 cm），用0.025 mol/L pH7.8的磷酸緩沖液洗脫，流速為1.5 mL/管/4 min。以上各步均需測(cè)蛋白質(zhì)的含量和酶的活力。

1.3.3 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法[2]，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：A595nm=0. 0825+0. 0083×蛋白質(zhì)含量

1.3.4 SOD純度的鑒定—PAGE電泳[2]

1.3.5 綠豆芽SOD的鑒定[3]

1.3.5.1 H2O2對(duì)綠豆芽SOD活力抑制

取4只潔凈試管，各加入 15%H2O215、20、25、30μL及適量層析SOD酶液，于30℃水浴恒溫30 min，取出迅速冷卻至25℃，測(cè)定酶活力，并計(jì)算其相對(duì)活力。

1.3.5.2 KCN對(duì)綠豆芽SOD活力抑制

取6只潔凈試管，各加入10 mmol/L KCN 100、200、300、400、500、600μL及適量綠豆芽SOD酶液。于30℃水浴恒溫30 min，取出迅速冷卻至25℃，測(cè)定酶活力，并計(jì)算其相對(duì)活力。

1.3.6 綠豆芽SOD固定化酶制備[4]

取5支潔凈的小燒杯，按表1加樣并混勻，于4℃冰箱中靜置24 h后即得固定化酶膠體。

1.3.7 綠豆芽SOD活力的測(cè)定

1.3.7.1 自由酶活力的測(cè)定

鄰苯三酚法[5]（前3 min與時(shí)間呈線性關(guān)系，經(jīng)計(jì)算得鄰苯三酚自氧化速率為0.070 nm/min。）

表1 固定化酶制備加樣表Table 1 The formula on preparation of immobilized superoxide dismutase

1.3.7.2 固定化酶活力的測(cè)定

取6支離心管，分別加入pH8. 20.1 mol/LTris-HCl緩沖液 4.5 mL，1 號(hào)試管加入蒸餾水 4.2 mL。2、3、4、5、6號(hào)試管加入蒸餾水4.1 mL，再分別加入用0.1 mL的游離酶液配制成固定化酶粉末，凝膠濃度分別為17.5%、20.0%、22.5%、25.0%、27.5%，混勻后于25℃預(yù)熱20 min。然后分別加入25℃預(yù)熱過的鄰苯三酚0.3 mL（在1號(hào)管用0.3 mL 10 mmol/L鹽酸代替），開始計(jì)時(shí)，同時(shí)震蕩離心管，準(zhǔn)確反應(yīng)4 min后，立即分別加入1滴8 mol/LHCl終止反應(yīng)。將6支離心管置離心機(jī)中，8000 r/min離心10 min，取上清夜，以1號(hào)管為空白管，在420 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光值。

1.3.7.3 洗滌酶活力的測(cè)定

將凝膠濃度分別為17.5%、20.0%、22.5%、25.0%、27.5%的固定化酶取出，碎成1 mm見方的小顆粒，裝入層析柱，用少量雙蒸水洗滌3～4次，合并洗滌液，進(jìn)行酶活力測(cè)定，方法同1.3.7.1。

1.3.7.4 固定化結(jié)果分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH磷酸緩沖液對(duì)綠豆芽SOD提取結(jié)果的影響

不同pH磷酸緩沖液對(duì)綠豆芽SOD提取結(jié)果的影響見圖1。

圖1 不同pH緩沖液中的SOD活力Fig.1 Activity of SOD in different pH

圖1表明，磷酸緩沖液的pH在7.7～8.0范圍內(nèi)，pH7.8時(shí)提取液中SOD的活力最高，當(dāng)緩沖液中含有0.1 mmol/L EDTA時(shí)，溶液中SOD的活力則大幅度升高。因而取0.05 mol/L pH7.8（內(nèi)含0.1 mmol/L EDTA）的磷酸緩沖液來提取綠豆芽SOD。

2.2 不同硫酸銨濃度對(duì)綠豆芽SOD純化結(jié)果的影響

不同硫酸銨濃度對(duì)綠豆芽SOD純化結(jié)果的影響見圖2。

由圖2可以看出，用不同濃度的硫酸銨處理綠豆芽上清液，隨著硫酸銨濃度的增大，沉淀去除的蛋白質(zhì)越多，但酶的活力回收也越低，從去雜蛋白和活力回收這兩方面考慮，以40%飽和度硫酸銨最佳，這樣既可以去除更多的雜蛋白又保留較多的酶。

2.1 DEAE-纖維素-柱層析

DEAE-纖維素-柱層析見圖3。

圖3 DEAE-纖維素-柱層析Fig.3 DEAE-cellulose-column chromatography

由圖3可以看出，吸光值曲線有一個(gè)高峰和一個(gè)小峰，結(jié)合抑制率曲線分析可知小峰為雜蛋白。在吸光值曲線高峰管附近選擇酶活力較高的管進(jìn)行電泳和酶的固定化。

2.4 綠豆芽SOD純化結(jié)果

綠豆芽SOD純化結(jié)果見表2。

表2 綠豆芽SOD純化結(jié)果Table 2 The purified of mung bean sprouts SOD purified

由表2可以看出，粗提液經(jīng)鹽析和層析之后，酶的比活達(dá)到4.662×10-5kat/mg，總酶活回收率為43.7%，純化倍數(shù)為26.4。

2.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定綠豆芽SOD蛋白質(zhì)純度

聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定綠豆芽SOD蛋白質(zhì)純度見圖4、圖5。

圖4 電泳圖Fig.4 The electrophoretograms

圖5 層析酶的電泳分析圖Fig.5 The electrophoretic analysis chart of purified enzyme

由圖4可以看出，未層析酶的電泳圖中有3條帶，層析酶酶的電泳圖中有2條帶。從有關(guān)資料查證純化SOD酶的電泳圖中有2條帶，因而說明層析酶為純化的SOD。由圖5可知，層析酶的電泳圖中有2個(gè)遷移率峰，再次說明層析酶已為純化的SOD。

2.6 H2O2和KCN對(duì)綠豆芽SOD活力的抑制

H2O2和KCN對(duì)綠豆芽SOD活力的抑制見圖6。

圖6 H2O2和KCN對(duì)綠豆芽SOD活力的抑制Fig.6 The results of H2O2and KCN in hibiting the activity of mung bean sprouts SOD

由圖6可以看出，采用1.5%H2O2和10 mmol/L KCN作用于綠豆芽SOD30 min（30℃），隨著二者體積的加大，H2O2和KCN對(duì)SOD活力的抑制也逐漸增加，當(dāng)二者體積分別增大至30 μL及600 μL時(shí)，綠豆芽SOD的相對(duì)酶活力分別降低至15%及7%，這說明H2O2和KCN對(duì)SOD活力的抑制很顯著。而據(jù)資料[7]顯示，Mn-SOD對(duì)氰化物和過氧化氫均不敏感，Cu，Zn-SOD對(duì)氰化物和過氧化氫均敏感，F(xiàn)e-SOD對(duì)氰化物不敏感，這表明，綠豆芽SOD為Cu，Zn-SOD。

2.7 聚丙烯酰胺凝膠固定化SOD

聚丙烯酰胺凝膠固定化SOD見圖7。

圖7 不同濃度聚丙烯酰胺凝膠固定化SOD活力Fig.7 The activety of SOD immobilized with different concentration of polyacrylamide gelatin

由圖7可以看出，0.1 mL的綠豆芽SOD游離酶經(jīng)固定化后活性下降。其中22.5%的聚丙烯酰胺凝膠作包埋劑時(shí)活性較高。這是由于低濃度的聚丙烯酰胺固定化凝膠較稀，網(wǎng)孔較大，經(jīng)水洗時(shí)，可能損失較多，故活性喪失較大。而高濃度的聚丙烯酰胺固定化凝膠較硬，不利于催化底物發(fā)生反應(yīng)，則固定化酶的活性比較小。

采用22.5%的聚丙烯酰胺凝膠固定綠豆芽SOD，對(duì)固定化酶及游離酶的活力進(jìn)行比較，結(jié)果如表3所示。

從表3可以看出，固定化酶的結(jié)合效率達(dá)87.0%，其活力回收率為80.9%。固定化酶的酶活力小于游離酶，其原因可能是酶分子在固定化的處理過程中，空間構(gòu)象會(huì)發(fā)生變化。酶固定化后，其分子的空間自由度受到限制，影響酶分子活性中心對(duì)底物的定位作用。對(duì)于大分子底物如蛋白質(zhì)等生物大分子，酶反應(yīng)的空間效應(yīng)表現(xiàn)的更為明顯。同時(shí)因?yàn)檩d體的空隙太小，或者是固定方式與位置不當(dāng)，給酶的活性部位造成空間屏障。這種空間屏障使酶分子的活性基團(tuán)不易與底物或效應(yīng)物接觸，其直接結(jié)果是影響固定化酶的活力。

表3 固定化結(jié)果Table 3 The results on immobilizing superoxide dismutase

3 結(jié)論

1）用pH7.8磷酸緩沖液（內(nèi)含EDTA）提取SOD效果較好，可達(dá)3.571×10-7kat/20 g綠豆芽。

2）用40%飽和度的硫酸銨處理SOD粗提液，既可以去除更多的雜蛋白又可保留較多的酶，此時(shí)SOD的比活為8.301×10-6kat/mg。經(jīng)過進(jìn)一步透析、DEAE-纖維素-柱層析純化后，酶的純化程度可達(dá)4.662×10-5kat/mg蛋白，總酶活回收率43.7%，純化倍數(shù)26.4。

3）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果分析顯示SOD主要由2個(gè)亞基組成。

4）H2O2和KCN對(duì)綠豆芽SOD活力的抑制結(jié)果說明綠豆芽SOD為Cu，Zn-SOD。

5）包埋劑聚丙烯酰胺凝膠濃度為22.5%時(shí)，固定化酶的結(jié)合效率達(dá)87.0%，固定化酶的活力回收達(dá)80.9%。

[1] 王愛國(guó),羅廣華,邵從本,等.大豆種子超氧化物歧化酶的研究[J].植物生理學(xué)報(bào),1983,9(1)：77-83

[2] 陳鈞輝,陶力,李俊,等.生物化學(xué)試驗(yàn)[M].3版.北京：科學(xué)出版社,2007：63-64

[3] 余旭亞,趙聲蘭,李濤,等.仙人掌超氧化物歧化酶的分離純化及鑒定[J].云南化工,2000,27(3)：17-19

[4] 周詩(shī)毅.包埋法固定及固定化酶性質(zhì)的研究.華中師范大學(xué)學(xué)報(bào)[J].2005,39(1)：97-99

[5] 靜天玉,趙曉瑜.用終止劑改進(jìn)超氧化物歧化酶鄰苯三酚測(cè)活法[J].生物化學(xué)和生物物理進(jìn)展,1995,22(1)：84

[6] 鄒國(guó)林,羅時(shí)文,裘名宜.小白菜線粒體錳超氧化物歧化酶的純化和性質(zhì)研究[J].生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào),1992,24(2)：180-183