韓新鋒，凡琴，劉書(shū)亮，2，朱冬梅，2，賴(lài)海梅，2，吳聰明3，

1(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安，625014)

2(農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川雅安，625014)

3(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京，100193)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)廣泛存在于自然界，是引起食物中毒的重要致病菌，在美國(guó)、加拿大和中國(guó)引起的金黃色葡萄球菌食物中毒分別占整個(gè)細(xì)菌性食物中毒的33%、45%和50%［1］，由此造成的經(jīng)濟(jì)損失也相當(dāng)慘重。金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生多種外毒素，其中，以耐熱性腸毒素(Staphylococcal enterotoxins，SEs)引起的食物中毒最為普遍，已成為世界性衛(wèi)生問(wèn)題，包括中國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家都將金黃色葡萄球菌腸毒素作為國(guó)內(nèi)和國(guó)家進(jìn)出口食品微生物必檢指標(biāo)之一。金黃色葡萄球菌腸毒素是一類(lèi)結(jié)構(gòu)相關(guān)、毒力相似、抗原性不同的外毒素，迄今已發(fā)現(xiàn)十幾種金黃色葡萄球菌腸毒素并定位其基因，主要包括以下幾種類(lèi)型，即傳統(tǒng)類(lèi)型的SEA、SEB、SEC、SED和 SEE，新型的 SEG、SEH、SEI和 SEJ等［2］。引發(fā)的食物中毒95%與分型中的A、B、C、D及E型腸毒素相關(guān)［3］，其中A型和D型占主導(dǎo)地位，B型、C型次之，E型的出現(xiàn)率最低，各腸毒素毒力不一，A型毒素毒力較強(qiáng)，D 型較弱［4-5］。

乳及乳制品營(yíng)養(yǎng)成分比較完全，含有豐富的蛋白質(zhì)，是易被金黃色葡萄球菌污染的主要?jiǎng)游镄允称分唬?］。奶牛乳腺炎疾病是生鮮牛乳金黃色葡萄球菌一次污染的最主要原因，此外，生鮮牛乳擠出后，由于罐裝、貯藏、運(yùn)輸、消毒等條件不合格亦會(huì)造成金黃色葡萄球菌的二次污染［7-8］。近些年來(lái)，國(guó)內(nèi)外關(guān)于乳及乳制品中金黃色葡萄球菌污染、產(chǎn)腸毒素特性報(bào)道增多，分離株多攜帶腸毒素基因。乳及其成品中金黃色葡萄球菌及其腸毒素的存在已對(duì)食品安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。本文旨在調(diào)查四川乳品生產(chǎn)鏈中金黃色葡萄球菌的污染情況，分析分離株中最常見(jiàn)引起食物中毒的4種腸毒素基因的攜帶情況，為食源性金黃色葡萄球菌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估以及乳品生產(chǎn)中HACCP的建立提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品來(lái)源

2010年4月至2011年6月從四川省部分牛乳生產(chǎn)企業(yè)采集生鮮牛乳693份，生產(chǎn)車(chē)間半成品牛乳112份，成品牛乳88份，合計(jì)893份。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌株

金黃色葡萄球菌7147(SEA陽(yáng)性)、X1(SEB陽(yáng)性)、B4(SEC陽(yáng)性)、C8(SED陽(yáng)性)，作為SEs基因檢測(cè)的陽(yáng)性菌株。大腸桿菌ATCC25922、藤黃微球菌ATCC10209、腸炎沙門(mén)氏菌 C1CC21482，用于 SEs基因檢測(cè)陰性對(duì)照，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 培養(yǎng)基

7.5 %氯化鈉肉湯、Baird-Parker(B-P)瓊脂培養(yǎng)基、金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基、凍干兔血漿、卵黃亞碲酸鉀增菌液購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。金黃色葡萄球菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基，購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。無(wú)菌脫纖維兔血購(gòu)自成都奧克生物技術(shù)有限公司。

1.4 主要試劑

GoldViewTMDNA 染料、DL 2000 DNA Marker、溶菌酶購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。Taq DNA聚合酶、10 ×PCR buffer、dNTP mixture(2.5 mmol/L)、MgCl2(25 mmol/L)購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。TIANamp Bacteria DNA Kit提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.5 金黃色葡萄球菌的分離、鑒定

采集的樣品按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 4789.10—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)——金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》進(jìn)行檢驗(yàn)。具體方法如下:樣品經(jīng)7.5%氯化鈉肉湯增菌培養(yǎng)，B-P平板分離純化、選取B-P平板上疑似菌落再次劃線于B-P平板直至分純，對(duì)純化菌株進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢、溶血試驗(yàn)、血漿凝固酶試驗(yàn)及科瑪嘉顯色試驗(yàn)，分離鑒定出金黃色葡萄球菌。陽(yáng)性菌株加入終濃度為20%的甘油，-20℃保存。

1.6 多重PCR檢測(cè)SEs基因及16S rDNA

檢測(cè)的腸毒素基因分別為SEA、SEB、SEC、SED，16S rDNA為內(nèi)參基因，引物由寶生物工程(大連)有限公司合成(表1)。

表1 引物序列及產(chǎn)物大?。?-10］Table 1 Primer sequences and predicted sizes of PCR product for the amplification of S.aureus target genes

利用多重PCR對(duì)126株金黃色葡萄球菌的腸毒素基因攜帶情況進(jìn)行檢測(cè)。首先將菌株接種于5 mL LB肉湯，37℃培養(yǎng)24 h，收獲菌體，采用 TIANamp Bacteria DNA Kit提取試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆?。將菌?147、X1、B4基因組 DNA按1∶1∶1混合制成 SEA、SEB、SEC 陽(yáng)性模板，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

多重PCR檢測(cè)腸毒素基因的反應(yīng)系統(tǒng)經(jīng)優(yōu)化后采用2個(gè)擴(kuò)增體系。PCR反應(yīng)體系1(用于SEA、SEB、SEC 基因的檢測(cè)):10 ×PCR buffer 5 μL，MgCl2(25 mmol/L)4 μL，dNTPmixture(2.5 mmol/L)2 μL，DNA 模板 2 μL，SEA(10 μmol/L)、SEB(10 μmol/L)、SEC(10 μmol/L)引物各 0.75μL，Taq DNA 聚合酶(1.25 U)2 μL，滅菌超純水加至 50 μL。

PCR反應(yīng)體系2(用于SED基因的檢測(cè)):10×PCR buffer 5 μL，MgCl2(25 mmol/L)4 μL，dNTP mixture(2.5 mmol/L)2 μL，DNA 模板 2 μL，SED(10 μmol/L)引物 0.75 μL、16S rDNA 引物(10 μmol/L)0.15 μL，Taq DNA 聚合酶(1.25 U)2 μL，滅菌超純水加至 50 μL。

兩個(gè)體系的PCR反應(yīng)條件均為:94℃，10 min;之后 95℃，1 min，62℃，45 s，72℃，1 min，進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。吸取2 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上樣于2%瓊脂糖凝膠(0.5×TBE)，80 V電壓電泳30 min后，置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察、拍照，分析電泳結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌分離株的形態(tài)特征

金黃色葡萄球菌在B-P瓊脂平板上菌落呈圓形，表面光滑、凸起、濕潤(rùn)，直徑1 mm左右，灰黑至黑色，有光澤，有淺色(非白色)的邊緣，周?chē)@以不透明圈(沉淀)，其外常有一清晰帶，其直徑為3～5mm;在血瓊脂平板上菌落呈金黃色或白色，周?chē)腥苎?在科瑪嘉顯色平板上呈紅色或粉紅色;革蘭氏染色顯示，金黃色葡萄球菌為無(wú)芽孢、無(wú)莢膜成對(duì)或成堆排列的葡萄狀G+球菌(圖1)。

2.2 金黃色葡萄球菌分離株的生化鑒定結(jié)果

893份牛乳樣品經(jīng)增菌、分離培養(yǎng)和接觸酶試驗(yàn)后，參照GB/4789.10-2010對(duì)純化菌株進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢、溶血及血漿凝固酶試驗(yàn)，將純化分離株點(diǎn)種于科瑪嘉顯色培養(yǎng)基觀察顯色試驗(yàn)結(jié)果，共分離出191株金黃色葡萄球菌菌株(表2)。

圖1 金黃色葡萄球菌的菌落特征及個(gè)體形態(tài)特征Fig.1 Colony and individual morphous characteristics of S.aureus

表2 乳品生產(chǎn)鏈中金黃色葡萄球菌的鑒定結(jié)果Table 2 Phenotypic identification results of S.aureus in the milk production chain

2.3 金黃色葡萄球菌的污染情況

牛乳生產(chǎn)鏈各個(gè)環(huán)節(jié)金黃色葡萄球菌總檢出率為21.4%(191株)，生鮮牛乳、車(chē)間半成品牛乳和成品牛乳的檢出率分別為26.4%(183株)、7.1%(8株)及0.0%(0株)。

2.4 SEs基因的多重PCR檢測(cè)結(jié)果

2.4.1 腸毒素基因多重PCR檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件所建立的多重PCR方法針對(duì)SEA、SEB、SEC基因可在同一體系同時(shí)特異性地?cái)U(kuò)增出3條目的條帶，片段大小分別為521 bp、667 bp和284 bp。針對(duì)SED和內(nèi)參基因16S rDNA可在同一體系同時(shí)特異性地?cái)U(kuò)增出2條目的條帶，大小分別為385bp和228 bp，表明所建立的多重PCR方法檢測(cè)金黃色葡萄球菌的腸毒素基因準(zhǔn)確、可靠(圖2)。

2.4.2 SEA、SEB、SEC基因多重PCR檢測(cè)結(jié)果

圖2 多重PCR檢測(cè)金黃色葡萄球菌腸毒素基因和16S rDNA的特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Multiplex PCR results for the amplification of enterotoxin genes and 16s rDNA of S.aureus

來(lái)自不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)的121株金黃色葡萄球菌有16株攜帶SEA基因，13株攜帶SEB基因，7株攜帶SEC基因，以上菌株均為生鮮牛乳源。半成品牛乳樣品中未檢測(cè)出腸毒素基因攜帶菌株(圖3)。

圖3 多重PCR檢測(cè)牛乳生產(chǎn)鏈中部分金黃色葡萄球菌分離株SEA、SEB和SEC腸毒素基因電泳圖Fig.3 Examples of multiplex PCR results for the detection of SEA，SEB，SEC genes of S.aureus isolates

2.4.3 SED及16S rDNA目標(biāo)片段PCR鑒定

不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)的121株金黃色葡萄球菌有4株攜帶SED基因，且均為生鮮牛乳源;所有菌株均可擴(kuò)增出16S rDNA基因片段(圖4)。

圖4 多重PCR檢測(cè)牛乳生產(chǎn)鏈中部分金黃色葡萄球菌分離株SED腸毒素基因和16S rDNA電泳圖Fig.4 Examples of multiplex PCR results for the detection of SED gene and 16S rDNA of S.aureus isolates

2.5 各型腸毒素基因檢出率統(tǒng)計(jì)

121株金黃色葡萄球菌腸毒素基因總檢出率為22.3%(27株)，生鮮牛乳源、中間過(guò)程乳源及成品乳源菌株腸毒素基因攜帶率分別為23.9%(27株)、0.0%(0株)及0.0%(0株)。不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)的121株金黃色葡萄球菌單一SEA、SEB、SEC、SED基因檢出率分別為 9.0%(11株)、4.1%(5株)、0.8%(1株)及0.8%(1株)。同時(shí)攜帶SEA-SEB、SEB-SEC、SEA-SED、SEA-SEB-SEC、SEB-SEC-SED 基因的菌株檢出率分別為1.6%(2株)、1.6%(2株)、0.8%(1株)、1.6%(2株)、1.6%(2 株)。各分型 SEA、SEB、SEC、SED基因的總檢出率分別為13.2%(16株)、10.7%(13株)、5.8%(7 株)、3.3%(4 株)，生鮮牛乳源金黃色葡萄球菌各分型SEA、SEB、SEC、SED基因的總檢出率與整體差異不大，分別為14.2%(16株)、11.5%(13 株)、6.2%(7 株)、3.5%(4 株);車(chē)間半成品牛乳和成品牛乳未檢出攜帶 SEA、SEB、SEC、SED基因的金黃色葡萄球菌。金黃色葡萄球菌分離株攜帶的腸毒素基因總的情況為，分離株中SEA、SEB基因的存在比例較高，其它依次是SEC和SED基因。

3 討論

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)將血漿凝固酶試驗(yàn)作為金黃色葡萄球菌判定的重要依據(jù)，但一些非金黃色葡萄球菌可以產(chǎn)生活性較大的蛋白酶(假凝固酶)使結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性。本試驗(yàn)在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，加做了金黃色葡萄球菌的科瑪嘉顯色試驗(yàn)，進(jìn)一步提高了金黃色葡萄球菌表型檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。16S rDNA是細(xì)菌鑒定、分類(lèi)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。在多重PCR體系2中，所建立的多重PCR能夠?qū)瘘S色葡萄球菌SED基因和保守序列同時(shí)進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示金黃色葡萄球菌分離株16S rDNA基因鑒定結(jié)果與表型鑒定的符合率為100.0%。

采用國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)四川省部分乳品企業(yè)牛乳生產(chǎn)鏈中金黃色葡萄球菌的污染情況顯示，金黃色葡萄球菌的總檢出率是21.4%，其中，生鮮牛乳的檢出率最高，為 26.4%，與 Normanno(38.4%)［4］、徐勤(15.20%)［11］、Lee(29.6%)［12］等的報(bào)道有所不同，表明生鮮牛乳中金黃色葡萄球菌的污染情況存在地區(qū)差異。易明梅［7］認(rèn)為飼養(yǎng)和擠奶等環(huán)節(jié)牛體衛(wèi)生消毒不徹底會(huì)導(dǎo)致奶牛相互之間金黃色葡萄球菌交叉污染致病;胡東良［13］對(duì)采集的340份生鮮乳進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)混裝奶桶(罐)生鮮乳的金黃色葡萄球菌污染率(58.8%)高于奶牛個(gè)體(39.0%)。值得注意的是，雖然牛乳在生產(chǎn)過(guò)程中通過(guò)超高溫瞬時(shí)殺菌(UHT)或巴氏殺菌，可以殺死牛乳中絕大多數(shù)病原微生物，但是如果原料乳中存在的金黃色葡萄球菌在合適條件下產(chǎn)生腸毒素，由于其具有高度的熱穩(wěn)定性，不能通過(guò)熱力殺菌消除，依然會(huì)對(duì)乳品的質(zhì)量安全帶來(lái)隱患。因此，要減少金黃色葡萄球菌對(duì)生鮮牛乳的污染，除降低奶牛乳腺炎疾病的患病率和淘汰患化膿性乳腺炎的奶牛外，還應(yīng)及時(shí)將擠出的乳迅速冷至10℃以下，定期對(duì)奶罐、奶車(chē)、牛奶貯藏罐及生產(chǎn)環(huán)境進(jìn)行消毒。隨著生產(chǎn)鏈的延伸，半成品牛乳及成品牛乳的污染率降低至7.1%和0.0%，與Normanno［4］、Can［14］、張?zhí)m榮［15］等報(bào)道結(jié)果基本一致。為防止食物中毒事件的發(fā)生，必須高度重視乳制品的金黃色葡萄球菌及其腸毒素的監(jiān)測(cè)，加強(qiáng)對(duì)原料牛乳的監(jiān)控，嚴(yán)格控制生產(chǎn)工藝流程中各個(gè)可能污染環(huán)節(jié)，重視對(duì)包裝材料的消毒，避免成品牛乳受外界因素的影響而再次污染，保障產(chǎn)品檢驗(yàn)合格方可出廠。

金黃色葡萄球菌新型腸毒素的檢出比例日益增多，腸毒素蛋白純化以及特異性抗體的制備難度較大，使得ELISA方法在腸毒素檢測(cè)及腸毒素分型中應(yīng)用的局限性越來(lái)越明顯。用PCR技術(shù)監(jiān)測(cè)食品中金黃色葡萄球菌及其腸毒素基因或?qū)ζ溥M(jìn)行分型具有特異性好、靈敏度高、節(jié)約時(shí)間的特點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。Peles等［8］利用多重PCR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)27.1%牛奶源金黃色葡萄球菌攜帶SEs基因，其中以SEB基因最普遍;Pereira等［9］利用多重PCR對(duì)148株食源性金黃色葡萄球菌檢測(cè)發(fā)現(xiàn)69%的分離株攜帶 SEs基因，其中以 SEA-SEG、SEA-SEG-SEI、SEGSEI基因攜帶菌株最為普遍;張嚴(yán)峻等［16］對(duì)生鮮牛乳源金黃色葡萄球菌的腸毒素基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，65.5%的菌株攜帶腸毒素基因，其中51.7%的菌株攜帶SEA基因，17.2%的菌株攜帶其他傳統(tǒng)腸毒素基因(SEB～SEE)，41.2%的菌株攜帶新型腸毒素基因(SEG～SEJ)。本研究中22.3%(27株)的菌株攜帶一種及多種腸毒素基因，低于上述報(bào)道，以SEA基因的攜帶率最高，為13.2%，其次為SEB基因，SED基因的攜帶率最低，說(shuō)明SEA在金黃色葡萄球菌引起的食物中毒中占有重要地位，與國(guó)外SEB基因在牛乳源金黃色葡萄球菌中分布比例較高［2，8］或SEA基因最高、SED其次［17］的研究結(jié)果存在差異，這可能與分離株地域、宿主差異等不同有關(guān)。處于生產(chǎn)鏈不同環(huán)節(jié)的分離株腸毒素基因分布情況有很大差異，生鮮牛乳中腸毒素基因攜帶菌株檢出率為23.9%，車(chē)間半成品牛乳和成品牛乳未檢測(cè)出腸毒素基因攜帶菌株。

有研究表明，腸毒素編碼基因常出現(xiàn)在質(zhì)粒、原噬菌體、毒力島上，在一個(gè)獨(dú)立單元上，它們可同時(shí)攜帶一種或多種腸毒素基因，如SEB-SElK-SElQ存在于毒力島 SaPI1上，SEC-SElL-txt存在于毒力島 SaPI2上，SEC-SElL存在于毒力島SaPI3上，SEA由噬菌體φSa3mu攜帶，SED 由質(zhì)粒 PIB485攜帶［18］。因此，同一株菌可同時(shí)攜帶兩種或兩種以上的腸毒素基因，且不同基因型的檢出率與菌株有一定的關(guān)聯(lián)度。曹虹等［19］認(rèn)為各腸毒素型之間關(guān)系最為密切的是SEA與SEC，Akindden等［20］發(fā)現(xiàn)患乳房炎奶牛產(chǎn)的牛奶中分離的腸毒素基因SED和SEJ基因的檢出呈完全的連鎖關(guān)系。本文所分離的9株生鮮牛乳源金黃色葡萄球菌攜帶有多種腸毒素基因型(SEA-SEB 2株;SEB-SEC 2株;SEA-SED 1株;SEA-SEB-SEC 2株;SEB-SEC-SED 2株)，且不同基因型的檢出率與菌株具有一定的關(guān)聯(lián)性。各腸毒素分型間關(guān)系最為密切的是SEB和SEC基因(6株同時(shí)攜帶SEB和SEC基因)，其次為SEA和SEB(4株同時(shí)攜帶SEA和SEB基因)，觀察發(fā)現(xiàn)，SEC與SEA、SEC及SED的出現(xiàn)也呈現(xiàn)一定的連鎖關(guān)系。

本文研究了四川地區(qū)乳品生產(chǎn)加工環(huán)節(jié)中金黃色葡萄球菌的污染情況，分析了乳品生產(chǎn)鏈中金黃色葡萄球菌分離株腸毒素基因的分布規(guī)律，為乳及其制品中由腸毒素引起的食源性疾病的暴發(fā)提供了監(jiān)測(cè)、追蹤依據(jù)，為食品安全監(jiān)管提供了數(shù)據(jù)支持。

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