閆 雪 劉文靜 張?zhí)炝?趙 會(huì) 李鋒杰 于 麗 江 洪2

（濰坊醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室；1濰坊醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院，山東261053；2濰坊市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科 山東261041）

神經(jīng)管畸形（neural tube defect，NTD）是人類(lèi)在胚胎早期發(fā)育過(guò)程中由于神經(jīng)管閉合不全而引起的一類(lèi)先天缺陷，也是胚胎和圍產(chǎn)兒致殘的主要原因，包括無(wú)腦、露腦、脊柱裂、腦積水等多種臨床表型。NTD是人類(lèi)出生缺陷中較為常見(jiàn)的一種出生缺陷，影響1‰的胎兒存活率［1］。目前引起孕產(chǎn)婦NTD的原因有很多，尤其是高熱、糖尿病、高胰島素血癥、肥胖、各種社會(huì)生理和心理因素［2］。其中高溫是最為常見(jiàn)的物理致畸因素之一。人類(lèi)約10%的神經(jīng)管畸形為孕早期高熱所致，但高溫誘發(fā)NTD確切的分子機(jī)制仍不清楚［3］。轉(zhuǎn)錄抑制因子（Hairy and enhancer of split homolog－1，Hes1）屬于bHLH堿性－螺 旋－環(huán)－螺旋 （basic－h(huán)elix－loop－h(huán)elix）轉(zhuǎn) 錄 因子超家族HES／HEY成員之一，是Notch信號(hào)通路的下游靶基因，下傳Notch信號(hào)，可使多種不成熟細(xì)胞維持在未分化狀態(tài)，調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)分化誘導(dǎo)因子的反應(yīng)，維持未分化細(xì)胞數(shù)量上的穩(wěn)定，使干細(xì)胞處于增殖狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)在高溫致NTD模型上，通過(guò)Western blot技術(shù)和免疫熒光染色技術(shù)觀(guān)察Hes1在胎鼠神經(jīng)上皮細(xì)胞的表達(dá)變化，探討Hes1與神經(jīng)管發(fā)育和高溫致畸發(fā)生之間的關(guān)系，為防治NTD的發(fā)生提供理論依據(jù)。

材料和方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及標(biāo)本制備

成年未經(jīng)產(chǎn)雌性金黃地鼠50只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，體重100±10g，鼠顆粒飼料喂養(yǎng)，常規(guī)飲水。于晚7－9時(shí)與雄鼠1∶1合籠，次日查有精子者定為孕第1d（E1）。將孕鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組于E8下午3－4時(shí)，置42℃水浴，持續(xù)20min，水浴后16h、24h、36h、48h（相當(dāng)于E8.5、E9、E9.5、E10）將孕鼠處死，剖腹取鼠胚，制備高溫致NTD動(dòng)物模型；對(duì)照組置37℃水浴，持續(xù)20min，在相同的時(shí)間點(diǎn)取材。分別用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，厚5μm，裱片后備染。

2.Western blot技術(shù)

解剖顯微鏡下分離神經(jīng)管組織，將神經(jīng)管組織置于冰上，4℃12000r／min離心15min，提取上清，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。將20μg蛋白樣品進(jìn)行10%SDS－PADE電泳，恒壓90V將蛋白轉(zhuǎn)自PVDF膜（Millipore），轉(zhuǎn)膜時(shí)間1h。將PVDF膜置于5%脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉抗原2h后放入TBST稀釋一抗兔抗 Hes1（1∶1000，Abcam）中4℃冰箱孵育過(guò)夜，用TBST稀釋羊抗兔IgG（1∶2500，Cell Signaling ）室溫?fù)u床2h，ECL 發(fā)光液（Thermo）反應(yīng)15min，在暗室中進(jìn)行曝光顯影定影。β－actin（1∶500，北京中杉金橋生物技術(shù)公司）作為對(duì)照，內(nèi)參檢測(cè)方法相同。利用凝膠成像儀灰度分析軟件進(jìn)行灰度值分析。

3.免疫熒光染色

切片常規(guī)脫蠟入水，0.01mol／L枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0）微波抗原修復(fù)，冷卻后用 PBS沖洗；滴加正常山羊血清，37℃孵育30min，分別滴加兔抗Hes1（1∶200，Abcam），4 ℃冰箱過(guò)夜；分別滴加TRITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶100，北京中杉金橋生物技術(shù)公司），避光條件下37℃孵育50min；滴加 Hoechst（1∶800，Molecular Probes），37℃避光孵育30min，PBS沖洗；以防淬滅封片劑封片，4℃冰箱避光保存；熒光顯微鏡觀(guān)察、拍照。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，以檢查免疫熒光反應(yīng)的特異性。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

每組取免疫熒光切片10張，經(jīng)正置熒光顯微鏡（LEICADM1000）觀(guān)察拍片，將所得圖片在IPP6.0圖像分析軟件中進(jìn)行圖像分析，經(jīng)剪除背景，屏分割和選擇刪除后，測(cè)量各組陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞的平均光密度（OD值）。每組取5張Western blot顯影膠片置于掃描儀掃描，用Quntity one圖像分析軟件測(cè)定Western blot顯示條帶的光密度值，進(jìn)行目的條帶與內(nèi)參條帶光密度比值計(jì)算、分析。應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析，將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組相應(yīng)部位的OD值（平均光密度±標(biāo)準(zhǔn)差）作t檢驗(yàn)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01差異具有顯著性。

結(jié) 果

1.Western blot檢測(cè)結(jié)果

E8.5－E10，對(duì)照組金黃地鼠胚胎神經(jīng)管組織中Hes1穩(wěn)定表達(dá)，且無(wú)明顯量的變化（P＞0.05）。與對(duì)照組相比，高溫組各時(shí)間點(diǎn)（E8.5，E9，E9.5，E10）Hes1蛋白的表達(dá)呈不同程度的降低，尤其是E8.5和E9.5差異明顯（＊P＜0.05）（圖1）。

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組和NTD組金黃地鼠神經(jīng)管組織中Hes1蛋白水平。A.E8.5－E10，對(duì)照組和NTD組金黃地鼠Hes1蛋白水平；B.E8.5－E10，對(duì)照組和NTD金黃地鼠Hes1蛋白水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（＊P＜0.05）Fig.1Hes1protein level of neural tube tissue in the control and NTD golden hamster at different points.A.E8.5－E10，Western blot detection of Hes1protein level in the control and NTD golden hamster at different points.B.E8.5－E10，Statistical analysis of Hes1protein level in the control and NTD golden hamster at different points（＊P＜0.05）.

2.Hes1免疫熒光染色結(jié)果

E8.5－E10，Hes1在鼠胚神經(jīng)管上皮細(xì)胞和周?chē)g充質(zhì)細(xì)胞的胞漿廣泛表達(dá)；E9.5、E10，Hes1陽(yáng)性表達(dá)主要分布于腹側(cè)和腹外側(cè)上皮細(xì)胞中。E8.5－E10，高溫組胚胎神經(jīng)上皮細(xì)胞內(nèi)的Hes1表達(dá)量較對(duì)照組均有不同程度的減弱，其中E8.5、E9.5差異顯著（P＜0.05）（圖2）。

圖2 免疫熒光染色示各時(shí)間點(diǎn)Hes1在胚胎神經(jīng)上皮細(xì)胞中的表達(dá)。A：Hes1免疫熒光染色結(jié)果：a－d.分別代表對(duì)照組E8.5，E9，E9.5，E10；e－h(huán)分別代表高溫組E8.5，E9，E9.5，E10。bar＝50μm。B：OD值的統(tǒng)計(jì)結(jié)果（＊P＜0.05）。紅色代表Hes1，藍(lán)色代表Hoechst。Fig.2Hes1immunofluorescent staining of embryonic neuroepithelial cells in different time.A：Hes1immunofluorescent staining results：a－d.control groups E8.5－E10；e－h(huán).NTD groups E8.5－E10.bar＝50μm.B：The statistical result of OD.（＊P＜0.05）.Red represents Hes1，blue represent Hoechst.

討 論

胚胎發(fā)育是一個(gè)受基因嚴(yán)密調(diào)控的過(guò)程，致畸原可通過(guò)直接或間接作用干擾已知或未知發(fā)育關(guān)鍵基因的表達(dá)，如發(fā)育基因、受體基因、生理因子基因以及原癌基因等［4］。NTD是一組受多因素影響，涉及多個(gè)基因的復(fù)雜畸形，是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果［5］。其中高溫因素包括孕產(chǎn)婦流感、普通感冒、發(fā)熱和高熱等。在小鼠中大約有200個(gè)基因突變可以導(dǎo)致NTD，在人類(lèi)則表現(xiàn)為一個(gè)多因子的多基因或寡基因的病因?qū)W發(fā)生模式，說(shuō)明NTD中基因－基因之間，基因－環(huán)境之間相互作用的重要性［6］。研究發(fā)現(xiàn)，高溫可使與細(xì)胞增殖分化密切相關(guān)的蛋白特別是酶蛋白和信息蛋白表達(dá)異常，從而干擾細(xì)胞分化；高溫可使細(xì)胞周期阻滯，細(xì)胞分裂減少，細(xì)胞凋亡增加［7］。

Hes基因家族包括 Hes1－7，其中 Hes1是Notch信號(hào)通路的下游基因，大量表達(dá)于哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育過(guò)程中上皮細(xì)胞及神經(jīng)干細(xì)胞［8］。在人類(lèi)，此基因定位于3q28－q29，轉(zhuǎn)錄的mRNA由1471個(gè)堿基對(duì)組成，共包含有4個(gè)外顯子，其編碼的Hes1蛋白是由280個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量為29400。研究顯示胚胎腦組織中的神經(jīng)前體細(xì)胞保持未分化狀態(tài)需要Hes1的適當(dāng)表達(dá)，但Hes1的持續(xù)高表達(dá)會(huì)抑制細(xì)胞的分裂和增殖，因此Hes1在控制神經(jīng)前體細(xì)胞的數(shù)量以及神經(jīng)細(xì)胞的分化和增殖中具有十分重要的作用［9］?；虬邢蜃饔醚芯匡@示，Hesl基因敲除的小鼠Mashl表達(dá)量上調(diào)，新生神經(jīng)細(xì)胞過(guò)早成熟，最終出現(xiàn)神經(jīng)管發(fā)育缺陷甚至是胚胎的死亡［10］。

實(shí)驗(yàn)顯示神經(jīng)管發(fā)育過(guò)程中Hes1蛋白穩(wěn)定表達(dá)；但高溫后，NTD組Hes1表達(dá)降低，說(shuō)明高溫抑制了Hes1的表達(dá)。Taeko等［11］研究顯示Hes1對(duì)維持神經(jīng)干細(xì)胞狀態(tài)發(fā)揮重要作用，缺乏Hes1神經(jīng)干細(xì)胞將會(huì)過(guò)早分化。Hes1可以誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向中胚層分化，但在胚胎干細(xì)胞中胚層早期階段分化停止，說(shuō)明Hes1表達(dá)下調(diào)促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞中胚層分化，進(jìn)一步說(shuō)明Hes1抑制神經(jīng)干細(xì)胞的分化。郇林春［12］等研究發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中，Hes1蛋白功能的缺失可能會(huì)造成胚胎的無(wú)腦畸形，其過(guò)高表達(dá)可能會(huì)抑制神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖和分化，使神經(jīng)祖細(xì)胞保持在未分化狀態(tài)。在神經(jīng)干細(xì)胞中，Notch信號(hào)通路在維持神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化過(guò)程中起關(guān)鍵作用，Notch誘導(dǎo)Hes1／5的表達(dá)，抑制原始基因表達(dá)從而抑制神經(jīng)細(xì)胞的分化［13－14］。以上均說(shuō)明Hes1抑制神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化，從而維持神經(jīng)干細(xì)胞的原始狀態(tài)?？梢?jiàn)，高溫致NTD過(guò)程中，高溫抑制Hes1的表達(dá)，從而影響了神經(jīng)管的正常發(fā)育。由此說(shuō)明Hes1表達(dá)降低在高溫致NTD的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，這為進(jìn)一步闡明高溫致NTD的機(jī)制提供了理論依據(jù)。

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