羅明英 鄒智榮 范 艷 陳媛麗 劉承杏 蔡維君

（1昆明醫(yī)科大學(xué)人體解剖與組織胚胎學(xué)系，云南650500；2中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)系，長沙410003）

側(cè)支血管的生長是由原有的微小動(dòng)脈發(fā)育成較大的具有導(dǎo)血功能的動(dòng)脈血管的過程，能使血管的直徑增加20倍，體積增加50倍［1］。側(cè)支血管的重塑需要側(cè)支血管管壁各層結(jié)構(gòu)的激活，以保證側(cè)支血管的正常生長發(fā)育。如果側(cè)支血管管壁的重塑出現(xiàn)異常，則會(huì)導(dǎo)致異常的側(cè)支血管生長。激活側(cè)支血管管壁重塑的因素有許多，包括血流切應(yīng)力、炎癥細(xì)胞和基質(zhì)金屬蛋白酶等［2，3］。在以前的研究中我們觀察到去除神經(jīng)支配后，側(cè)支血管的生長異常，主要表現(xiàn)為血管管壁過度增生，血管管腔狹窄，側(cè)支血管數(shù)目減少的一種內(nèi)向性生長方式［4］。但造成側(cè)支血管異常生長竟是否是由于去神經(jīng)支配后影響了側(cè)支血管生長過程中血管壁激活的某些因素仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠后肢股動(dòng)脈結(jié)扎結(jié)合坐骨神經(jīng)和股神經(jīng)切除誘導(dǎo)側(cè)支血管生長模型，結(jié)合共聚焦免疫熒光術(shù)，觀察去除神經(jīng)支配后對大鼠后肢股動(dòng)脈結(jié)扎誘導(dǎo)的側(cè)支血管壁激活的影響，從而闡明去神經(jīng)支配后側(cè)支血管內(nèi)向性生長的可能影響因素。

材料和方法

1.動(dòng)物模型

健康成年SD大鼠26只（中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供），雌雄不限，體重200－220g，10%水合氯醛溶液（0.4μl／kg）腹腔注射麻醉，無菌條件下右下肢股后部縱切口約3cm，梨狀肌下暴露并切斷坐骨神經(jīng)，斷端埋入鄰近肌肉，術(shù)后消毒縫合皮膚，給予抗生素治療。存活1w后，對動(dòng)物重新麻醉，暴露并分離雙側(cè)股動(dòng)脈，在右側(cè)股深動(dòng)脈發(fā)出處用苯酚將股深動(dòng)脈上的神經(jīng)損毀，同時(shí)在股深動(dòng)脈的稍下方采用雙結(jié)扎法結(jié)扎股動(dòng)脈，然后再切斷股神經(jīng)，左側(cè)行單純股動(dòng)脈結(jié)扎。

2.取材，切片

分別存活1w和8w，動(dòng)物麻醉后快速取下雙側(cè)帶有側(cè)支血管的股薄肌，置液氮冷凍，OCT復(fù)合物進(jìn)行包埋處理，－80℃保存待用，用作免疫熒光組織化學(xué)染色。

3.免疫熒光染色

三頓冰凍切片機(jī)連續(xù)切片，片厚10μm，4%多聚甲醛固定15min，組織切片用1%BSA封閉，封閉后分別加入Vimentin（mouse，1∶600）、CD11b（mouse，1∶100）、MMP－2（rabbit，1∶200）的一抗，濕盒中4℃冰箱過夜，然后依據(jù)一抗的種屬分別加入生物素化的抗鼠、抗兔的二抗（1∶200），室溫孵育2h，最后加入鏈霉素－卵白素化Cy3（1∶400）和偶聯(lián)Rodamin的α－SM actin（1∶500）進(jìn)行雙標(biāo)，室溫孵育50min，其中除1%BSA孵育30min之外，其余各步均需用0.01mol／L PBS洗3次，每次10min。防熒光淬滅劑封片，Nikon激光共聚焦顯微鏡下拍片。

用5%BSA代替一抗作為陰性對照，排除二抗的非特異性染色。

4.定量分析

Nikon共聚焦顯微鏡下攝片后，采用EZ－C1 3.70FreeViewer圖像分析軟件分別對單純結(jié)扎側(cè)和結(jié)扎加去神經(jīng)側(cè)的Vimentin、CD11b和MMP－2的免疫熒光強(qiáng)度進(jìn)行測量，單位以每平方微米Arbitrary Units（AU／μm2）表示。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1.Vimentin免疫熒光染色

采用波形蛋白（Vimentin）作為外膜成纖維細(xì)胞和中膜平滑肌細(xì)胞合成表型的標(biāo)志物，同時(shí)為了區(qū)分血管中膜和外膜，我們用α－SM actin與其進(jìn)行熒光雙標(biāo)，觀察Vimentin在外膜和中膜的表達(dá)變化。

在正常血管，Vimentin的表達(dá)適度（圖1A）；1w后，Vimentin在單純結(jié)扎側(cè)和結(jié)扎加去神經(jīng)側(cè)的表達(dá)均增加，但是外膜Vimentin的表達(dá)在結(jié)扎側(cè)要比結(jié)扎加去神經(jīng)側(cè)高（圖1B，D）；8w后，Vimentin的表達(dá)在單純結(jié)扎側(cè)類似于正常血管，但在結(jié)扎加去神經(jīng)側(cè)，Vimentin在中膜表達(dá)仍然很高，并且在外膜的表達(dá)增加（圖1C，E）。中膜和外膜的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析見（圖2）。

圖2 1w、8wvimentin在單純結(jié)扎（LV）和結(jié)扎加去神經(jīng)（LDV）血管外膜和中膜比較。＊和＃：LV和LDV與正常血管（NV）比較（P＜0.001）；△和※：LDV與LV比較（P＜0.001）Fig.2The comparison of vimentin in the adventitia and tunic media between ligation（LV）and ligation plus denervation（LDV）in 1wor 8w.＊and＃ ：LV or LDV vs NV（P＜0.001）；△and※ ：LDV vs LV（P＜0.001）

2.CD11b和MMP－2免疫熒光染色

我們用CD11b作為巨噬細(xì)胞標(biāo)志物檢測了側(cè)支血管單核細(xì)胞／巨噬細(xì)胞浸潤的變化，以及用MMP－2抗體檢測基質(zhì)金屬蛋白酶在生長側(cè)支血管的表達(dá)。

在正常動(dòng)脈血管，外膜有少量的CD11b陽性細(xì)胞（圖3A）；1w后，在單純股動(dòng)脈結(jié)扎側(cè)，CD11b陽性細(xì)胞數(shù)目在側(cè)支血管外膜增多（圖3B），熒光強(qiáng)度為57.14±8.5AU／μm2；而在股動(dòng)脈結(jié)扎加去神經(jīng)側(cè)，CD11b在外膜的表達(dá)則明顯減少（圖3C），熒光強(qiáng)度為22.52±7.8AU／μm2。

在正常動(dòng)脈血管，MMP－2在外膜的表達(dá)弱（圖3D）；1w后，在單純股動(dòng)脈結(jié)扎側(cè)，MMP－2在外膜的表達(dá)明顯增強(qiáng)（圖3E），熒光強(qiáng)度為103.49±21.3AU／μm2；單純股動(dòng)脈結(jié)扎加去神經(jīng)側(cè)，MMP－2在外膜的表達(dá)相對較低（圖3F），熒光強(qiáng)度為48.12±13.7AU／μm2。與單純股動(dòng)脈結(jié)扎側(cè)相比，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）。

圖4 1wCD11b和 MMP－2在單純結(jié)扎（LV）和結(jié)扎加去神經(jīng)（LDV）比較。＊和＃：LDV與LV比較（P＜0.001）Fig.4The comparison of CD11b 和 MMP－2between ligation（LV）and ligation plus denervation（LDV）in 1w.＊和＃：LDV vs LV （P＜0.001）

討 論

以往的研究表明，外膜的激活和積極的重塑在側(cè)支血管的發(fā)育中起著重要的作用，可以確保側(cè)支血管外向性的生長，允許形成更大的側(cè)支動(dòng)脈［5］。側(cè)支血管外膜的重塑主要包括外膜成纖維細(xì)胞的激活和細(xì)胞外基質(zhì)的降解。其中外膜成纖維細(xì)胞的激活和增殖是側(cè)支血管外向性生長的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，且常伴隨著細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶的激活，降解細(xì)胞外基質(zhì)如彈性纖維，允許血管壁的外向性擴(kuò)張生長，從而發(fā)育成較大的具有導(dǎo)血功能的動(dòng)脈血管［6，7］。在本實(shí)驗(yàn)中我們觀察到單純股動(dòng)脈結(jié)扎后，Vimentin在外膜以及基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)明顯增強(qiáng)，使得彈性成分和細(xì)胞外基質(zhì)得以降解，有利于側(cè)支血管的向外生長。而在去神經(jīng)后，側(cè)支血管外膜成纖維細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶在外膜的表達(dá)減少，因而可能影響了血管壁外膜的激活和細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而限制了側(cè)支血管外向性的生長。

在動(dòng)脈生成中，單核細(xì)胞／巨噬細(xì)胞雖然在血管中膜和內(nèi)膜也可見，但通常大部分聚集在外膜。它們是動(dòng)脈生成過程中外膜積極重塑的重要指征，因?yàn)樗鼈兡芊置谏L因子如FGF和PDGF以及基質(zhì)金屬蛋白酶，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和降解細(xì)胞外基質(zhì)為細(xì)胞遷移提供便利［8，9］。在我們的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，去神經(jīng)支配后，外膜單核細(xì)胞／巨噬細(xì)胞的浸潤減少。同時(shí)在我們早期的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在去除神經(jīng)支配后，細(xì)胞增殖率降低［10］。這說明由于血管壁失去了神經(jīng)支配，外膜成纖維細(xì)胞和基質(zhì)金屬蛋白的表達(dá)減少，細(xì)胞增殖率降低，從而降低了血管外膜的激活，因此限制了側(cè)支血管的外向性生長。

Kacem［11］等的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在去除動(dòng)脈的神經(jīng)支配后，Vimentin在SMC的表達(dá)增加，這表明神經(jīng)直接指導(dǎo)著SMC的去分化和遷移。并且，交感神經(jīng)的切除術(shù)會(huì)加速股動(dòng)脈SMCs的遷移和去分化，增加動(dòng)脈粥樣硬化的斑塊［12］。在我們的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，去神經(jīng)后Vimentin在血管中膜的表達(dá)仍然很高，而結(jié)合上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在血管外膜的激活受到影響的前提下，中膜的過度激活則會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致血管管壁增厚，管腔變窄，從而呈現(xiàn)一種內(nèi)向性的生長方式。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果在發(fā)現(xiàn)去除神經(jīng)支配后側(cè)支血管生長方式變化的前期工作基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察到在后肢血管阻塞的情況下，增加的血流以及同時(shí)引起的缺血缺氧等局部微環(huán)境刺激了血管壁的神經(jīng)，影響側(cè)支血管生長過程中血管壁激活的因素，從而參與調(diào)節(jié)側(cè)支血管的生長，完善了神經(jīng)調(diào)節(jié)對側(cè)支血管生長作用的認(rèn)識(shí)，為缺血性疾病的治療尋找新的促側(cè)支血管生長的途徑。

［1］Schaper J and Weihrauch D.Collateral vessel development in the porcine and canine heart.In：Collateral Cir－culation－Heart，Brain，Kidney，Limbs，edited by Schaper W and Schaper J.Boston，MA：Kluwer，1993，65－102

［2］Deindl E，Buschmann I，Hoefer I，et al.Role of ischemia and of hypoxia－inducible genes in arteriogenesis after femoral artery occlusion in the rabbit.Circ Rec，2001，89：779－786

［3］Price RJ，Less JR，Van Gieson EJ，et al.Hemodynamic stresses and structural remodeling of anastomosing arteriolar networks：design principles of collateral arterioles.Microcirculation，2002，9：111－124

［4］羅明英，伍校瓊，楊寶林等.去神經(jīng)支配對鼠后肢缺血誘導(dǎo)側(cè)支血管生長方式的調(diào)節(jié).中國臨床解剖學(xué)雜志，2011，29（6）：668－671

［5］Cai WJ，Koltai S，Kocsis E，et al.Remodeling of the adventitia during coronary arteriogenesis.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2003，284（1）：H31－H40

［6］Cai W，Vosschulte R，Afsah－Hedjri A，et al.Altered balance between extracellular proteolysis and antiproteolysis is associated with adaptive coronary arteriogenesis.J Mol Cell Cardiol，2000，32（6）：997－1011

［7］Yang HT，Deschenes MR，Ogilvie RW，et al.Basic fibroblast growth factor increases collateral blood flow in rats with femoral arterial ligation.Circ Res，1996，79（1）：62－69

［8］Shimokado K，Raines EW，Madtes DK，et al.A significant part of macrophage－derived growth factor consists of at least two forms of PDGF.Cell，1985，43（1）：277－286

［9］Hu JH，Du L，Chu T，et al.Overexpression of urokinase by plaque macrophages causes histological features of plaque rupture and increases vascular matrix metalloproteinase activity in aged apolipoprotein e－null mice.Circulation，2010，121（14）：1637－1644

［10］羅明英，伍校瓊，楊寶林等.神經(jīng)因素對缺血誘導(dǎo)的側(cè)枝血管生長過程中Ki67和α－SM－actin表達(dá)的影響.中國臨床解剖學(xué)雜志，2010，28（6）：677－679

［11］Kacem K，Seylaz J，Issertial O，et al.Chemical sympathectomy favours vimentin expression in arterial smooth muscle cells of young rats.J Auton Nerv Syst，1995，53（1）：57－68

［12］Kacem K，Sercombe C，Hammami M，et al.Sympathectomy causes aggravated lesions and dedifferentiation in large rabbit atherosclerotic arteries without involving nitric oxide.J Vasc Res，2006，43（3）：289－305

圖 版 說 明

圖1 Vimentin免疫熒光染色A：正常；B、C：單純結(jié)扎1w和8w；D、E：結(jié)扎加去神經(jīng)1w和8w（紅色：vimentin；綠色：α－SM actin；藍(lán)色：DAPI）（Bar＝30μm）

圖3 CD11b和 MMP－2免疫熒光染色1wA、B、C：CD11b在正常、單純結(jié)扎和結(jié)扎加去神經(jīng)；D、E、F：MMP－2在正常、單純結(jié)扎和結(jié)扎加去神經(jīng)（綠色：CD11b和MMP－2；藍(lán)色：DAPI）（Bar＝20μm）

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1Vimentin immunofluorescence staining A：normal；B、C：Ligation in 1wor 8w；D、E：Ligation plus dennervation in 1wor 8w （red：vimentin；green：α－SM actin；blue for nuclei）

Fig.3CD11band MMP－2immunofluorescence staining in 1wA、B、C：CD11bin normal，LV and LDV；D、E、F：MMP－2in normal，LV and LDV （green：CD11b and MMP－2；blue for nuclei）